[發明專利]一種腫瘤早早期動物模型的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202011118562.8
• 申請日: 2020-10-19
• 公開（公告）號: CN112400806A
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 尹悅;蔣瑞蘭;沈明望
• 申請（專利權）人: 蔣瑞蘭
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12Q1/6886;C12Q1/6809;G16B20/00
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 屠沛

1.一種腫瘤早早期動物模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)對非人哺乳動物的腫瘤細胞進行體外培養和傳代擴增；

2)將步驟1)擴增后的腫瘤細胞胰酶消化，清洗重懸后計數；

3)將步驟2)清洗重懸后的腫瘤細胞稀釋為預先確定的早早期動物模型注射濃度；

4)選擇與所述腫瘤細胞來源物種遺傳背景相匹配的非人哺乳動物，對其接種步驟3)得到的腫瘤細胞懸液；

5)接種后14～30天，獲得早早期動物模型；

以上步驟3)中所述確定早早期動物模型注射濃度的實驗過程如下：

a)根據確定的腫瘤細胞成瘤注射的最佳濃度，將步驟2)清洗重懸后的腫瘤細胞稀釋為低于所述最佳濃度的多個濃度梯度腫瘤細胞懸液；

b)選擇與所述腫瘤細胞來源物種遺傳背景相匹配的非人哺乳動物，并對其分組接種所述多個濃度梯度腫瘤細胞懸液；

c)觀察記錄接種腫瘤細胞后非人哺乳動物的成瘤情況；

d)接種后14～30天，將暫未出現腫瘤或出現微小腫瘤但未進入快速增長期的非人哺乳動物篩選出；其中，對暫未出現腫瘤的非人哺乳動物繼續觀察其成瘤生長曲線來確認其被篩選時是否處于腫瘤早早期，對出現微小腫瘤但未進入快速增長期的非人哺乳動物實驗解剖來確認其被篩選時是否處于腫瘤早早期，由此來確定早早期動物模型注射濃度。

2.根據權利要求1所述腫瘤早早期動物模型的構建方法，其特征在于：

所述步驟1)中，所述腫瘤細胞來源于細胞系或者原代腫瘤細胞；

所述步驟2)中，所述清洗重懸是指采用等滲鹽溶液清洗重懸；所述計數是指采用細胞計數儀器計數。

3.根據權利要求1或2所述腫瘤早早期動物模型的構建方法，其特征在于：

所述步驟3)中，所述腫瘤細胞成瘤注射的最佳濃度為1×10⁵～5×10⁶個/100μL/只動物；

所述步驟4)中，所述接種為皮下注射或者原位注射。

4.根據權利要求3所述腫瘤早早期動物模型的構建方法，其特征在于：

步驟3)中c)，所述觀察記錄是指使用游標卡尺或動物腫瘤成像手段觀察記錄腫瘤的大小；

步驟3)中d)，在接種后14～30天，將暫未出現腫瘤或出現微小腫瘤但未進入快速增長期的非人哺乳動物篩選出并抽血留存血樣；所述早早期動物模型注射濃度較所述成瘤注射的最佳濃度低1～2個數量級。

5.根據權利要求1所述腫瘤早早期動物模型的構建方法，其特征在于：

所述非人哺乳動物為野生型非基因改造非免疫缺陷鼠或野生型大鼠。

6.采用權利要求1腫瘤早早期動物模型的構建方法構建的動物模型在篩選生物標志物方面以及腫瘤免疫研究方面的應用。

7.取權利要求1構建的早早期動物模型進行篩選生物標志物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1)選取同物種的陰性對照組動物及腫瘤組動物，并分別對陰性對照組、腫瘤組以及所述早早期動物模型組的動物進行取血，分離得到血小板樣品；

S2)分別提取步驟S1)所有血小板樣品的總RNA，進行血小板基因檢測；

S3)分析步驟S2)的基因檢測結果，篩選早早期動物模型組與腫瘤組和陰性對照組相比特異的具有表達差異的基因，并經實驗驗證后，作為生物標志物。

8.根據權利要求7所述篩選生物標志物的方法，其特征在于：

所述步驟S1)中，取血來源于外周血，且取血分離血小板后立即加入TRIzol試劑裂解低溫保存或加入RNA保護劑適溫保存。

9.根據權利要求8所述篩選生物標志物的方法，其特征在于：

所述步驟S2)中，采用轉錄組測序或者基因芯片進行血小板基因檢測。

10.根據權利要求9所述篩選生物標志物的方法，其特征在于：

所述步驟S3)中，篩選生物標志物是指利用測序或芯片結果進行生物信息學分析或者采用人工智能手段對大數據直接進行分析后，進行實驗驗證的過程。