[發明專利]一種提高dcaps標記檢測效率的方法

有效

• 申請號: 202011118509.8
• 申請日: 2020-10-19
• 公開（公告）號: CN112322708B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發明（設計）人: 李瑋;宋國琦;李根英;李玉蓮;張淑娟;張榮志;李吉虎;高潔
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 劉紅陽

1.一種提高dcaps標記檢測效率的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、選取目的基因序列：提取已知小麥抗葉銹基因Lr67和其野生型病感基因；

S2、dCAPS引物設計：提取S1中小麥抗葉銹基因Lr67配合dCAPS Finder2.0設備制備正常序列長度引物；所述正常序列長度引物序列為SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；

S3、引物序列長度擴增：將S2中制備引物進行一定序列長度擴增；所述序列長度擴增即通過在小麥抗葉銹基因Lr67序列中引入Hinfl酶切位點的引物，同時將引入的Hintl酶切位點引物的5’端添加30bp-40bp的多聚嘌呤或多聚嘧啶制得增長序列長度后的引物，所述引物序列為SEQ ID No.5；

S4、PCR擴增小麥抗葉銹基因Lr67：使用PCR擴增設備使S3中引物正常進行小麥抗葉銹基因Lr67的PCR擴增；

S5、瓊脂糖凝膠預備：向每100mlTAE電泳緩沖液中添加1g瓊脂糖，混合搖勻混合溶液，將混合均勻后溶液放置于加熱設備中加熱至瓊脂糖完全溶解后取出，待混合溶液冷卻至60℃后加入EB染液搖勻；

S6、電泳條件預備：將S4中混合溶液注入用膠帶密封兩端后的膠板中，并選取適當規格梳子插入膠板內部，室溫狀態下等待混合溶液凝固，再取下混合溶液凝固后膠板兩端膠帶，將凝固后混合溶液放置于電泳槽內部，并向電泳槽內部添加TAE電泳緩沖液，之后垂直方向拔出梳子；

S7、標記基因、檢測：用移液器吸取S1中野生型病感基因和S4中小麥抗葉銹基因Lr67于封口膜上，再加入載樣緩沖液，將混合后的溶液混勻后注入點樣孔，啟動電泳槽，取出電泳處理后的固態混合溶液，并將固態混合溶液置于EB染液中進行染色處理，將染色處理后的固態混合溶液用清水適當漂洗后置于紫外投射檢測儀上進行標記效果比對觀察。

2.根據權利要求1所述的一種提高dcaps標記檢測效率的方法，其特征在于，所述多聚嘌呤和多聚嘧啶為多聚腺嘌呤與多聚胸腺嘧啶中的任意一種或多種。

3.根據權利要求1所述的一種提高dcaps標記檢測效率的方法，其特征在于，根據S5中操作步驟，所述瓊脂糖含量為2%，所述EB染液用量為100μl，且EB染液濃度為0.5mg/ml。

4.根據權利要求1所述的一種提高dcaps標記檢測效率的方法，其特征在于，根據S6中操作步驟，所述TAE電泳緩沖液液面覆蓋固態混合溶液高度為1-2mm。

5.根據權利要求1所述的一種提高dcaps標記檢測效率的方法，其特征在于，根據S6中操作步驟，所述注入膠板中混合溶液溫度為45℃-50℃。

6.根據權利要求1所述的一種提高dcaps標記檢測效率的方法，其特征在于，根據S7中操作步驟，所述野生型病感基因和小麥抗葉銹基因Lr67用量均為4μl。

7.根據權利要求1所述的一種提高dcaps標記檢測效率的方法，其特征在于，根據S7中操作步驟，所述載樣緩沖液為正常濃度的6倍，且載樣緩沖液用量為2μl。

8.根據權利要求1所述的一種提高dcaps標記檢測效率的方法，其特征在于，根據S7中操作步驟，所述電泳槽啟動持續時間為30-60min，啟動電壓為3-5V。

9.根據權利要求1所述的一種提高dcaps標記檢測效率的方法，其特征在于，根據S7中操作步驟，所述EB染液染色時間5-10min。