[發明專利]一種提高dcaps標記檢測效率的方法

有效

• 申請號: 202011118509.8
• 申請日: 2020-10-19
• 公開（公告）號: CN112322708B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發明（設計）人: 李瑋;宋國琦;李根英;李玉蓮;張淑娟;張榮志;李吉虎;高潔
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 劉紅陽

本發明提供一種提高dcaps標記檢測效率的方法，涉及分子生物學技術領域。該提高dcaps標記檢測效率的方法，包括以下步驟：S1、選取目的基因序列：提取已知小麥抗葉銹基因Lr67和其野生型病感基因，S2、dCAPS引物設計：提取S1中小麥抗葉銹基因Lr67配合dCAPS Finder2.0設備制備正常序列長度引物，S3、引物序列長度擴增：將S2中制備引物進行一定序列長度擴增。該提高dcaps標記檢測效率的方法，在dCAPS在引物中引入酶切位點，引物的長度一般為20bp左右，因此PCR酶切后產生比原來短20bp左右片段，要區分20bp的片段差異一般需采用聚丙烯酰胺凝膠電泳來分離，本發明在引物5’端加上30bp以上的尾巴序列，使酶切后野生型和突變體的片段大小差異增加到50bp以上。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，特別的為一種提高dcaps標記檢測效率的方法。

背景技術

單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）是分布最廣，數量最多的遺傳標記，當SNP位點恰好位于限制性酶切位點時可以利用酶切擴增多態性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS）技術來檢測，但是這種情況比較少，（Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，dCAPS）技術是CAPS的擴展，通過在SNP附近設計引物時引入錯配堿基，從而產生或者去除限制性內切酶識別位點進行檢測，通過CAPS和dCAPS技術可以檢測幾乎所有的SNP位點，但是現有技術中，在dCASP技術引入的錯配堿基在引物序列中，即酶切位點在引物末端附近，一般的引物長度為20bp左右，所以酶切產物的片段大小差異一般為20bp左右，這樣的差異利用瓊脂糖電泳來分離非常困難，若采用分辨率高的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，則需要花費更多的時間和精力用于復雜的凝膠制備和染色，因此，dCAPS檢測效率在實際應用中受到限制，使實際標記檢測效率較低。

發明內容

本發明提供的發明目的在于提供一種提高dcaps標記檢測效率的方法，能夠有效簡化實際檢測流程，縮短實際電泳時間，便于進行目標基因的的染色，進而有效提高實際檢測效率。

為實現以上目的，本發明通過以下技術方案予以實現：一種提高dcaps標記檢測效率的方法，包括有以下步驟：

S1、選取目的基因序列：提取已知小麥抗葉銹基因Lr67和其野生型病感基因。

S2、dCAPS引物設計：提取S1中小麥抗葉銹基因Lr67配合dCAPS Finder2.0設備制備正常序列長度引物。

S3、引物序列長度擴增：將S2中制備引物進行一定序列長度擴增。

S4、PCR擴增小麥抗葉銹基因Lr67：使用PCR擴增設備使S3中引物正常進行小麥抗葉銹基因Lr67的PCR擴增。

S5、瓊脂糖凝膠預備：向每100mlTAE電泳緩沖液中添加1g瓊脂糖，混合搖勻混合溶液，將混合均勻后溶液放置于加熱設備中加熱至瓊脂糖完全溶解后取出，待混合溶液冷卻至60℃后加入EB染液搖勻。

S6、電泳條件預備：將S4中混合溶液注入用膠帶密封兩端后的膠板中，并選取適當規格梳子插入膠板內部，室溫狀態下等待混合溶液凝固，再取下混合溶液凝固后膠板兩端膠帶，將凝固后混合溶液放置于電泳槽內部，并向電泳槽內部添加TAE電泳緩沖液，之后垂直方向拔出梳子。

S7、標記基因、檢測：用移液器吸取S1中野生型病感基因和S4中小麥抗葉銹基因Lr67于封口膜上，再加入載樣緩沖液，將混合后的溶液混勻后注入點樣孔，啟動電泳槽，取出電泳處理后的固態混合溶液，并將固態混合溶液置于EB染液中進行染色處理，將染色處理后的固態混合溶液用清水適當漂洗后置于紫外投射檢測儀上進行標記效果比對觀察。