[發明專利]自動化分離系統快速提取COVID-19患者康復期血漿的方法

有效

• 申請號: 202011118392.3
• 申請日: 2020-10-19
• 公開（公告）號: CN112225799B
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 魏卿;肖海蓉;劉慶喜
• 申請（專利權）人: 英科博雅基因科技（天津）有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/16;A61K9/08;A61K47/02;A61K39/42;A61P31/14
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1.快速分離獲取用以制備靜注COVID-19免疫球蛋白G的血漿的方法，其包括如下步驟：

(1)、通過靜脈穿刺法采集的SARS-CoV-2自然感染并通過血清抗體滴度/血清中和抗體滴度確認后的康復者的外周血250mL，置血液采集袋內，將血液采集袋置于水平搖床上充分混勻15分鐘；

(2)、使用封閉式多細胞組分自動化分離系統，將一次性使用分離杯的塑料針頭插入到血液采集袋上的無菌接口內，將采血袋掛起，使其中的60ml血液自然流入分離杯內的中央艙室；在加入血液前所述中央艙室內預先添加有0.6ml分離助劑；用無菌接合儀焊接管路將血液采集袋與一次性分離杯分離，再使該一次性分離杯置于水平搖床上充分混勻10分鐘；所述分離助劑是包含油酸鈉和硫酸鎂的滅菌水溶液，其中油酸鈉濃度為5%，硫酸鎂濃度以鎂離子計為0.5mol/L；所述封閉式多細胞組分自動化分離系統是ThermoGenesis Corp.生產的PXP? System；

(3)、將一次性分離杯配平后放置于可編程的離心機進行離心操作，并按照如下程序設定離心機的參數：

在離心的初始高速部分即2000RCF期間，外周血樣本中的細胞通過密度分層在一次性使用分離杯中分為三個組分：紅細胞層、細胞濃縮層、血漿層；

將速度降低至50RCF，并且在此第一次低速離心期間，大部分紅細胞被引導至紅細胞回收艙；

短暫增加速度至500RCF，以進一步將處理室中的細胞分層；

再次降低至50RCF，進一步除去紅細胞；

在采集血漿之前，相對離心力短暫增加至250RCF，在此期間，細胞濃縮層和血漿進一步分層；

再次降低至50RCF，細胞濃縮層通過輸送管轉移至回收艙室，使大部分血漿保留在中央艙室中；

(4)、離心機減速并停止旋轉，在一次性分離杯中分別單獨采集紅細胞、細胞濃縮層、血漿；

(5)、利用無菌接管機連接一次性分離杯上中央艙室的管路和轉移袋的管路，將中央艙室中的分離后的血漿轉移至轉移袋內；用無菌接合儀焊接管路后，將分離后的血漿用亞甲藍光化學法病毒滅活，然后在6h內快速凍結至-20℃以下，保存，得到血漿，其備用于制備靜注COVID-19免疫球蛋白G的制劑。

2.根據權利要求1的方法，其所獲得的血漿中丙氨酸氨基轉移酶活性低于40U/L。

3.根據權利要求1的方法，其所獲得的血漿之HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗體、HCV抗體用經批準的檢測試劑盒檢測后為陰性。

4.根據權利要求1的方法，其所獲得的血漿中，蛋白質含量高于50g/L。

5.根據權利要求1的方法，步驟(1)所述血液采集袋內包含抗凝劑。

6.根據權利要求5的方法，其中所述抗凝劑是枸櫞酸鈉。

7.根據權利要求1的方法，所述分離助劑是照如下方法配制的：將規定量的油酸鈉和硫酸鎂溶解于注射用水中，用0.45μm微孔濾膜過濾，封裝于玻璃瓶中，121°C熱壓滅菌15分鐘，即得。

8.制備靜注COVID-19免疫球蛋白G制劑的方法，該方法包括如下步驟：

(1)如權利要求1~7任一項所述獲得血漿組分；

(2)采用低溫乙醇法沉淀血漿，得到組分I+II+III；

(3)組分I+II+III壓濾后，組分II與組分I+III分離；

(4)組分II的沉淀溶解及柱層析純化后超濾，得到免疫球蛋白G半成品1；

(5)組分I+III的沉淀溶解及柱層析純化后超濾，得到免疫球蛋白G半成品2；

(6)將半成品1、2合并，除菌過濾和滅活病毒后，得到COVID-19免疫球蛋白G原液；

(7)免疫球蛋白G原液經配制、分裝，得到可供靜脈注射使用的靜注COVID-19免疫球蛋白G制劑。

9.根據權利要求8的方法，其包括如下步驟：

(1)如權利要求1~7任一項所述獲得血漿組分；

(2)將步驟(1)所得凍存的血漿置于融漿罐內進行融化，離心除去冷沉淀，用生理鹽水稀釋至血漿的蛋白含量在4.5~5.5g/L范圍內，調節至pH5.95±0.05，接著緩慢添加乙醇使乙醇濃度達到19%，靜置10~12h，壓濾至過濾液澄清透亮，壓濾機上的沉淀即為組分I+II+III；將組分I+II+III沉淀用10倍重量的0～4℃低溫注射用水溶解，調整pH值至4.70～4.80并充分攪拌，接著調整pH值至5.20±0.05并繼續攪拌；緩慢添加乙醇使乙醇濃度達到14%，調整pH值至5.20±0.05，在-3.5℃ ~ -4.5℃溫度范圍內放置12h；向物料罐中添加助濾劑，壓濾至過濾液澄明透亮時，分離出包含組分I+III的沉淀、包含組分II的上清，向組分II中添加乙醇至乙醇濃度為25%，壓濾，得到包含組分II的沉淀物；

(3)將步驟(2)所得組分II沉淀用注射用水溶解稀釋后加助濾劑深層過濾至溶液澄清透亮；上樣至DEAE Sepharose Fast Flow凝膠柱，用pH4.0醋酸洗脫液進行洗脫，截留的目標組分用孔徑為30kD的超濾膜進行超濾透析至蛋白含量≥50g/L，得到免疫球蛋白G半成品1；

(4)將步驟(2)所得組分I+III沉淀用20mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液攪拌溶解，升溫至20℃±1℃，噴淋方式加入正辛酸至濃度為20mmol/L后，劇烈攪拌以沉淀雜質蛋白，用壓濾機壓濾，獲得澄清透明的濾液，收集上清溶液；將該上清溶液調節pH至5.7±0.3，0.22μm膜過濾，加載到Macro cap Q離子交換柱上用醋酸-醋酸鈉緩沖液洗脫進行柱層析，收集的洗脫液用納米膜過濾，除去包括細小病毒在內的潛在病毒，得到濾液；濾液調整pH4.2±0.2，用含40mmol/L醋酸溶液的注射用水進行超濾脫鹽，超濾膜截留規格為10kDa的相對分子質量，使制品pH維持在4.5±0.05、電導率≤1ms/cm后，進行濃縮，得到蛋白質含量大于50g/L的制品，其為免疫球蛋白G半成品2；

(5)將步驟(3)和步驟(4)所得半成品1和半成品2混合，經納濾除菌、低孵放滅活病毒后，得到作為半成品的免疫球蛋白G原液，其亦稱為靜注COVID-19免疫球蛋白G原液；接著將該靜注COVID-19免疫球蛋白G原液用0.9%氯化鈉注射液稀釋配制成可供靜脈注射使用的靜注COVID-19免疫球蛋白G制劑，即為成品。