[發明專利]一種人甲狀旁腺激素真核表達重組質粒載體及其構建方法

在審

• 申請號: 202011114208.8
• 申請日: 2020-10-19
• 公開（公告）號: CN112143755A
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 趙振林;樊敏;黃晨宸;趙晨野
• 申請（專利權）人: 深圳市瑞普遜科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/62;A61K38/29;A61K48/00;A61K47/64;A61P5/18
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本發明涉及基因藥物領域，具體提供了一種人甲狀旁腺激素真核表達重組質粒載體及其構建方法。該構建方法包括如下步驟：人工合成甲狀旁腺激素（hPTH1?84aa)基因（SEQ ID NO.1）,經PCR擴增獲得甲狀旁腺激素基因片段，用限制性內切酶BamHI和XhoI雙酶切PCR產物后,與經相同酶切的真核表達載體質粒PHY?810連接,將連接好的表達載體轉化感受態細菌,涂板篩選得到人PTH基因真核表達重組質粒載體（圖1：PHY?PTH）。本發明所構建的真核表達重組質粒載體使細胞高表達PTH，可用于針對甲狀旁腺功能減退癥和骨質疏松的基因治療。

技術領域

本發明涉及基因藥物領域，特別涉及針對甲狀旁腺功能減退基因治療的重組質粒載體構建。

背景技術

甲狀旁腺素是由人甲狀旁腺分泌的活性多肽類激素，其主要生理功能是通過調節骨細胞和腎細胞維持血鈣平衡，刺激腎對鈣的重吸收、磷的分泌和骨的重建,是調節鈣磷代謝的重要肽類激素。

甲狀旁腺機能減退癥是由于疾病、衰老和手術損傷引起的甲狀旁腺激素分泌不足所導致的一種鈣磷代謝調節障礙性疾病。疾病、衰老導致的甲狀旁腺機能減退癥以脫鈣、骨骼再生障礙、骨質疏松為特征；手術損傷引起的甲狀旁腺機能減退癥又分為暫時型和永久型，主要臨床特征以低血鈣導致的低鈣抽搐和心血管系統功能障礙為特征。

由于疾病、衰老導致的甲狀旁腺機能減退癥，多見于老年化、孕產婦、更年期婦女、長期使用糖皮質激素的自免疾病患者和腫瘤患者。臨床上表現為骨質疏松，隨著老年化趨勢凸顯，發病率持續攀升，中國目前的骨質疏松人數達到2.5億。 手術損傷引起的甲狀旁腺(PTG)損傷是急性繼發性甲狀旁腺機能減退癥主要原因。我國每年由于甲狀旁腺損傷導致甲旁功能減退達到50萬以上，到2019年，中國永久性甲狀旁腺損傷累計人數超過500萬。

針對甲狀旁腺機能減退癥，目前除了補鈣等對癥替代療法，尚無有效對策。甲狀旁腺激素補充和替代療法成為從源頭上阻斷疾病發生發展的主要策略。隨著基因工程技術發展，美國禮來制藥公司首先開發出針對提升甲狀旁腺激素水平的基因工程產品-重組人甲狀旁腺激素（PTH1-34aa）注射液（特立帕肽注射液），2002年獲得美國FDA批準上市，2011 年3月份，被中國國家食品藥品監督管理局批準在中國上市，用于治療甲旁低和鈣磷代謝障礙導致的嚴重骨質疏松。

但現用的重組人甲狀旁腺激素制劑存在不足之處，影響力臨床使用。首先重組PTH在體內在體內代謝快，很不穩定，需每日定時用藥維持血藥濃度，因此增加了用藥難度和影響療效；第二是毒副作用，用藥后可出現眩暈，肌肉酸痛，呼吸困難，惡心嘔吐；更大的限制是本品治療最長時間不能超過24個月，而且病人終生只可以介紹一次最長24個月的治療。第三是制備成本高：由于PTH表達產物含量很低，分離純化困難，導致制備成本高，藥物昂貴，限制了規模化使用。

人們不斷在重組PTH制備工藝和產品結構上進行改進和優化，設法克服和彌補現用重組PTH制劑的缺陷，所以目前國內外針對甲旁素的基因工程技術專利主要集中在優化重組人甲狀旁腺激素產品性能和提升產量等方面。如：范文超于2012年申請了發明專利【人甲狀旁腺激素1-34 的制備方法】(CN 102304518 A)，該發明將編碼人甲狀旁腺激素的基因與硫氧還蛋白標簽融合表達，并進一步構建高表達PTH工程菌; 丁邦等發明專利【重組人甲狀旁腺激素PTH1-34 的制備方法】（CN 1807456 B）提供了含重組人甲狀旁腺激素的Trx-PTH1-34 融合蛋白，趙彬等的發明專利（CN 1256431C）構建了基因重組表達載體和重組人PTH的制備方法。從專利查詢平臺檢索已申報的相關PTH基因工程產品專利，絕大部分是關于重組甲狀旁腺激素制備的專利，其余部分是關于甲狀旁腺激素制劑等相關專利，但是到目前為止，未能從根本上突破重組PTH制劑的局限性。