[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)基因抗蟲豇豆的培育方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011112289.8
• 申請日: 2020-10-16
• 公開（公告）號: CN112048520B
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李漢霞;葉志彪;王文乾;張余洋;歐陽波;張俊紅;王濤濤;楊長憲
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/32;A01H5/00;A01H6/54;A01H4/00
• 代理公司: 武漢藍(lán)寶石專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 王振宇

本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因抗蟲豇豆的培育方法，其包括如下步驟：獲取豇豆無菌子葉節(jié)；構(gòu)建含pUBI、Cry1C*基因的質(zhì)粒，其中，所述pUBI的序列如SEQ?ID?NO:1所示，所述Cry1C*基因的序列如SEQ?ID?NO:2所示；利用攜帶含pUBI、Cry1C*基因的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌浸染豇豆無菌子葉節(jié)，誘導(dǎo)形成愈傷組織，分化出不定芽，生根，長成豇豆植株，從中篩選含Cry1C*基因的轉(zhuǎn)基因豇豆植株；采用轉(zhuǎn)基因豇豆植株自交，獲得純合的轉(zhuǎn)基因豇豆品種。該培育方法能夠培育出抗螟鱗翅目害蟲的轉(zhuǎn)基因抗蟲豇豆品種。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種轉(zhuǎn)基因抗蟲豇豆的培育方法。

背景技術(shù)

豇豆(Vigna?unguiculata(L.)Walp.)是豆科豇豆屬的一年生蔬菜作物，具有極高的營養(yǎng)價值。豇豆莢螟(Maruba?testulalis)，為螟鱗翅目害蟲，是豇豆生產(chǎn)中的主要害蟲之一，主要危害豆莢，嚴(yán)重影響著豇豆的產(chǎn)量和外觀等品質(zhì)。

然而，目前，市場上并沒有出現(xiàn)抗豇豆莢螟等害蟲的豇豆品種或種質(zhì)材料。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，有必要提供一種轉(zhuǎn)基因抗蟲豇豆的培育方法，以獲得具有抗螟鱗翅目害蟲的轉(zhuǎn)基因豇豆品種。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

一種轉(zhuǎn)基因抗蟲豇豆的培育方法，包括如下步驟：

獲取豇豆無菌子葉節(jié)；

構(gòu)建含pUBI、Cry1C*基因的質(zhì)粒，其中，所述pUBI的序列如SEQ?ID?NO:1所示，所述Cry1C*基因的序列如SEQ?ID?NO:2所示；

利用攜帶所述含pUBI、Cry1C*基因的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌浸染豇豆無菌子葉節(jié)，誘導(dǎo)形成愈傷組織，分化出不定芽，誘導(dǎo)生根，長成豇豆植株，從中篩選含Cry1C*基因的轉(zhuǎn)基因豇豆組織、不定芽、根或植株(轉(zhuǎn)基因植株的篩選可以在細(xì)胞階段、愈傷組織階段、不定芽階段、生根階段和植株階段的任一階段)；

采用轉(zhuǎn)基因豇豆植株自交，獲得純合的轉(zhuǎn)基因豇豆品種。

在其中一個實施例中，以序列如SEQ?ID?NO:3所示的pUBI-Fw和序列如SEQ?ID?NO:4所示的Cry1C*-Rv為引物，利用PCR法篩選。

在其中一個實施例中，所述PCR的反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性3min，94℃變性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，變性、退火、延伸重復(fù)34個循環(huán)，最后72℃延伸5min，16℃孵育10min。

在其中一個實施例中，所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲豇豆的培育方法還包括以序列如SEQ?IDNO:5所示的Cry1C*-Q-Fw和序列如SEQ?ID?NO:6所示的Cry1C*-Q-Rv為引物、采用Q-PCR法鑒定Cry1C*基因在轉(zhuǎn)基因豇豆植株體內(nèi)表達(dá)情況的步驟。

在其中一個實施例中，所述Q-PCR的反應(yīng)程序如下：首先，50℃預(yù)熱2min，95℃預(yù)變性10min；其次，95℃變性15s,58℃退火20s，72℃延伸20s，循環(huán)40次；最后，融合曲線95℃運行15s，60℃1min，95℃15s。

在其中一個實施例中，所述豇豆為金福臨門或武蔬白豇或小仁白子或春寶1號或武蔬4號或武蔬3號。

在其中一個實施例中，所述豇豆為蔬4號、金福臨門或武蔬3號。

在其中一個實施例中，誘導(dǎo)形成愈傷組織所采用的培養(yǎng)條件為：采用MS固體培養(yǎng)基，黑暗條件下26±2℃培養(yǎng)，所述MS固體培養(yǎng)基中的有機(jī)成分為維生素B₅。