[發明專利]一種轉基因抗蟲豇豆的培育方法

有效

• 申請號: 202011112289.8
• 申請日: 2020-10-16
• 公開（公告）號: CN112048520B
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發明（設計）人: 李漢霞;葉志彪;王文乾;張余洋;歐陽波;張俊紅;王濤濤;楊長憲
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/32;A01H5/00;A01H6/54;A01H4/00
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 王振宇

1.一種轉基因抗蟲豇豆的培育方法，其特征在于，包括如下步驟：

獲取豇豆無菌子葉節；

構建含pUBI、Cry1C*基因的pCAMBIA1300質粒，其中，所述pUBI的序列如SEQ?ID?NO:1所示，所述Cry1C*基因的序列如SEQ?ID?NO:2所示；

利用攜帶含所述pUBI、Cry1C*基因質粒的農桿菌浸染豇豆無菌子葉節，誘導形成愈傷組織，分化出不定芽，誘導生根，長成豇豆植株，從中篩選含Cry1C*基因的轉基因植株，其中誘導形成愈傷組織所用的培養基的配制方法為：取配制好的20x大量元素?50?mL、200x微量元素?5?mL、200x鐵鹽5?mL、蔗糖30?g、瓊脂粉?7.4?g，調整pH?5.8，定容至1000mL，滅菌冷卻后加入維生素B₅?1mg；

分化出不定芽所用的培養基的配制方法為：取配制好的20x大量元素50?mL、200x微量元素?5?mL、200x鐵鹽?5?mL、蔗糖30g、瓊脂粉7.4?g，調整PH?5.8，定容至1000mL，滅菌冷卻后加入維生素B_5?1mg、6-芐氨基嘌呤?1?mg、?激動素?0.1?mg、特美汀?200?mg；

生根所用的培養基的配置方法為：取配制好的20x大量元素50?mL、200x微量元素?5mL、200x鐵鹽5?mL、200x有機成分?5?mL、蔗糖30?g、瓊脂粉7.4?g，調整pH?5.8，定容至1000mL，滅菌冷卻后加入IBA?0.5?mg、特美汀?50?mg或者100mg;

其中，大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分按照標準MS培養基的配方配制；

將轉基因豇豆植株自交，獲得純合的轉基因豇豆品種。

2.根據權利要求1所述的轉基因抗蟲豇豆的培育方法，其特征在于，以序列如SEQ?IDNO:3所示的pUBI-Fw和序列如SEQ?ID?NO:4所示的Cry1C*-Rv為引物，利用PCR法篩選。

3.根據權利要求2所述的轉基因抗蟲豇豆的培育方法，其特征在于，所述PCR的反應程序如下：94℃預變性3min，94℃變性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，變性、退火、延伸重復34個循環，最后72℃延伸5min，16℃孵育10min。

4.根據權利要求1所述的轉基因抗蟲豇豆的培育方法，其特征在于，還包括以序列如SEQ?ID?NO:5所示的Cry1C*-Q-Fw和序列如SEQ?ID?NO:6所示的Cry1C*-Q-Rv為引物、采用Q-PCR法鑒定Cry1C*基因在轉基因豇豆植株體內表達情況的步驟。

5.根據權利要求4所述的轉基因抗蟲豇豆的培育方法，其特征在于，所述Q-PCR的反應程序如下：首先，50℃預熱2min，95℃預變性10min；其次，95℃變性15s,58℃退火20s，72℃延伸20s，循環40次；最后，融合曲線95℃運行15s，60℃?1min，95℃?15s。

6.根據權利要求1所述的轉基因抗蟲豇豆的培育方法，其特征在于，誘導形成愈傷組織所采用的培養條件為：黑暗條件下26±2℃?培養。

7.根據權利要求1所述的轉基因抗蟲豇豆的培育方法，其特征在于，分化出不定芽所采用的培養條件為：26±2℃條件下16小時光照、8小時黑暗條件下依次交替培養。

8.根據權利要求1所述的轉基因抗蟲豇豆的培育方法，其特征在于，生根所采用的培養條件為：26±2℃條件下16小時光照、8小時黑暗條件下依次交替培養。