[發(fā)明專利]生產(chǎn)馬來(lái)酸的工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011111992.7
• 申請(qǐng)日: 2020-10-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112375723B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王佳;袁其朋;盛華康;申曉林;孫新曉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京化工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 北京思海天達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

1.一種生產(chǎn)馬來(lái)酸的工程菌，其特征在于：包括在宿主內(nèi)共表達(dá)編碼異分支酸合成酶（EntC）、異分支酸丙酮酸裂解酶（PchB）、水楊酸-5-羥化酶、馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶和馬來(lái)酰丙酮酸裂解酶的基因；所述水楊酸-5-羥化酶為NagAaGHAb，

并且所述宿主內(nèi)同時(shí)敲除了編碼pheA、tyrA、pykA和pykF的基因，在基因組內(nèi)源整合了編碼EntC和PchB的基因并用T7啟動(dòng)子控制表達(dá)；

并且所述宿主內(nèi)過(guò)表達(dá)編碼莽草酸激酶、DAHP合成酶、PEP合成酶和轉(zhuǎn)酮酶A的基因；所述宿主為大腸桿菌菌株BW25113（F’）。

2.構(gòu)建如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)馬來(lái)酸的工程菌的方法，其特征在于，包括步驟：

（1）構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒

將編碼異分支酸合成酶、異分支酸丙酮酸裂解酶、水楊酸-5-羥化酶NagAaGHAb、馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶和馬來(lái)酰丙酮酸水解酶的基因連接至表達(dá)質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒載體；

（2）構(gòu)建工程菌

將所述重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到宿主中，并且采用Red重組的方法敲除宿主中的pheA、tyrA、pykA和pykF基因，采用中拷貝質(zhì)粒共表達(dá)編碼莽草酸激酶、DAHP合成酶、PEP合成酶、轉(zhuǎn)酮酶A的基因，得到生產(chǎn)馬來(lái)酸的工程菌；所述宿主為大腸桿菌菌株BW25113（F’）。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：采用高拷貝質(zhì)粒表達(dá)水楊酸-5-羥化酶NagAaGHAb的基因，利用中拷貝質(zhì)粒表達(dá)馬來(lái)酰丙酮酸異構(gòu)酶和馬來(lái)酰丙酮酸水解酶的基因。

4.一種權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)馬來(lái)酸的工程菌的應(yīng)用，其特征在于：按照體積比1％～2％的接種量，將權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)馬來(lái)酸的工程菌接種到培養(yǎng)基中，并在菌株OD達(dá)到0.6時(shí)加入0.5mM誘導(dǎo)劑，在30℃進(jìn)行發(fā)酵處理，制得馬來(lái)酸；所述培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖或葡萄糖和甘油的組合。

5.根據(jù)權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于：所述培養(yǎng)基包括2g·L^-1MOPS(3-嗎啉丙磺酸)，5g·L?L^-1葡萄糖，30g·L^-1甘油，7g·L^-1酵母粉，3g·L^-1蛋白胨，17.1g·L^-1Na₂HPO₄·12H₂0，0.5g·L^-1NaCl，3g·L^-1KH₂PO₄，1g·L^-1NH₄Cl，245mg·L^-1MgSO₄，15mg·L^-1CaCl₂，其余部分用去離子水補(bǔ)充。