[發(fā)明專利]生產(chǎn)馬來酸的工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011111992.7
• 申請日: 2020-10-16
• 公開（公告）號: CN112375723B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王佳;袁其朋;盛華康;申曉林;孫新曉
• 申請（專利權(quán)）人: 北京化工大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 北京思海天達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

生產(chǎn)馬來酸的工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)馬來酸的工程菌，包括在宿主內(nèi)共表達編碼異分支酸合成酶、異分支酸丙酮酸裂解酶、水楊酸?5?羥化酶、馬來酰丙酮酸異構(gòu)酶和馬來酰丙酮酸裂解酶的基因。上述工程菌還包括在所述宿主內(nèi)過表達編碼莽草酸激酶、DAHP合成酶、PEP合成酶、轉(zhuǎn)酮酶A的基因來實現(xiàn)馬來酸的增產(chǎn)。本發(fā)明還提供一種上述生產(chǎn)馬來酸的工程菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用。利用上述生產(chǎn)馬來酸的工程菌，以葡萄糖和/或甘油等碳源來生產(chǎn)馬來酸，實現(xiàn)了馬來酸的從頭合成。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種生產(chǎn)馬來酸的工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

馬來酸又名順丁烯二酸，外觀為單斜晶系無色結(jié)晶。它在食品、醫(yī)藥、化妝品、材料等方面有著較廣泛的應(yīng)用。目前它的主要用途是合成不飽和聚酯樹脂，另外，它還可以作為原料生產(chǎn)酒石酸、琥珀酸、富馬酸等化合物，同時，它還可以作為食品調(diào)味劑，廣泛地被用作飲料的酸味劑。

馬來酸有著廣闊的市場前景。馬來酸加熱到135℃即可得到馬來酸酐，在?2007年，馬來酸酐的全球市場就已經(jīng)達到了1807000噸，而根據(jù)預(yù)測，在2023?年，馬來酸酐的全球市場將達到220萬噸。

目前馬來酸的工業(yè)生產(chǎn)100％采用化學(xué)法，主要是正丁烷氧化法、芳香苯氧化法和不飽和烯烴氧化法等，采用的原料都是不可再生能源，且化學(xué)法生產(chǎn)不可避免地會造成一定程度的環(huán)境污染問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明確有必要提供一種生產(chǎn)馬來酸的工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，以解決上述問題。

所以，本發(fā)明的第一個目的是從大量生物或微生物體內(nèi)能夠合成馬來酸的酶中篩選出在體外依然具有催化效率的酶來實現(xiàn)馬來酸的異源合成。為此，本發(fā)明優(yōu)選了來源于細菌、真菌或蛋白質(zhì)工程改造的酶的相關(guān)基因，通過這些酶的表達，利用簡單碳源實現(xiàn)了馬來酸的生物合成。

本發(fā)明的第二個目的在于提供高產(chǎn)馬來酸的宿主，通過向原始或改造過的細菌、真菌、酵母中導(dǎo)入一條高效生產(chǎn)馬來酸的途徑來生物合成馬來酸。

本發(fā)明的第三個目的在于通過抑制競爭途徑、模塊優(yōu)化等一系列代謝調(diào)控方式來提高馬來酸的產(chǎn)量。實驗結(jié)果表明，在正常條件下，代謝工程改造菌利用葡萄糖、甘油等簡單碳源來生產(chǎn)馬來酸，能達到53±6mg/L的產(chǎn)量，而在經(jīng)過優(yōu)化后，利用簡單碳源的代謝工程菌能達到2.35±0.02g/L的最終產(chǎn)量。

本發(fā)明涉及異源生物合成馬來酸的代謝途徑，通過增強上游分支酸合成途徑酶的表達，優(yōu)選來源于細菌、真菌或蛋白質(zhì)工程改造的外源酶，選用原始或改造過的細菌、酵母、真菌作為宿主細胞，成功實現(xiàn)了馬來酸的生產(chǎn)。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)馬來酸的工程菌，包括：在宿主內(nèi)共表達編碼異分支酸合成酶(EntC)、異分支酸丙酮酸裂解酶(PchB)、水楊酸5-羥化酶(NagAaGHAb)、馬來酰丙酮酸異構(gòu)酶(Mps)和馬來酰丙酮酸裂解酶(Hbzf)的基因。

其中，所述宿主為細菌、酵母或真菌，其中，所述細菌或真菌為原始的或改造過的。優(yōu)選地，所述宿主為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、釀酒酵母或黑曲霉。

基于上述生產(chǎn)馬來酸的工程菌，還包括在所述宿主內(nèi)過表達編碼莽草酸激酶(AroL)、丙酮酸激酶(ppsA)、轉(zhuǎn)酮酶(tktA)、3-脫氧-7-磷酸庚酸合酶?(AroG^fbr)的基因。

基于上述生產(chǎn)馬來酸的工程菌，還包括在所述宿主內(nèi)同時敲除了編碼?pheA、tyrA、pykA和pykF的基因

基于上述生產(chǎn)馬來酸的工程菌，還包括在所述宿主基因組內(nèi)整合了編碼?EntC和PchB的基因

本發(fā)明還提供了一種上述生產(chǎn)馬來酸的工程菌的構(gòu)建方法，包括步驟：