[發明專利]甲氧基去甲腎上腺素衍生物、免疫原、特異性抗體及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202011107928.1
• 申請日: 2020-10-16
• 公開（公告）號: CN112225672B
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 張小可;胡振陽;靳麗萍;王惠敏
• 申請（專利權）人: 長沙博源醫療科技有限公司
• 主分類號: C07C233/18
• 分類號: C07C233/18;C07C231/12;C07K14/765;C07K1/107;C07K16/18;C07K16/06;G01N33/74;G01N33/58;G01N33/543
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1.一種應用抗甲氧基去甲腎上腺素特異性抗體制備的甲氧基去甲腎上腺素檢測試劑，其特征在于，所述甲氧基去甲腎上腺素檢測試劑為甲氧基去甲腎上腺素均相酶免疫檢測試劑或甲氧基去甲腎上腺素膠乳增強免疫比濁檢測試劑；

所述甲氧基去甲腎上腺素均相酶免疫檢測試劑，由R1試劑與R2試劑組成，所述R1試劑包含所述的抗甲氧基去甲腎上腺素特異性抗體與R1緩沖液，所述R2試劑包含甲氧基去甲腎上腺素葡萄糖-6-磷酸脫氫酶標記偶聯物與R2緩沖液；

所述的R1緩沖液含有酶底物、輔酶、牛血清白蛋白及Tris緩沖液，所述的酶底物為葡萄糖-6-磷酸，所述的輔酶為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；

所述的甲氧基去甲腎上腺素葡萄糖-6-磷酸脫氫酶標記偶聯物由甲氧基去甲腎上腺素衍生物與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶偶聯而成；其結構式如式Ⅲ所示：

所述的R2緩沖液為含有牛血清白蛋白的Tris緩沖液；

所述甲氧基去甲腎上腺素膠乳增強免疫比濁檢測試劑，由L1試劑與L2試劑組成；

所述L1試劑由所述的抗甲氧基去甲腎上腺素特異性抗體、pH＝8.0的緩沖液、牛血清白蛋白、氯化鈉、吐溫-20、丙三醇、乙二胺四乙酸、促凝劑以及防腐劑組成；

所述L2試劑由甲氧基去甲腎上腺素-牛血清白蛋白復合體包被的聚苯乙烯膠乳顆粒、pH＝8.0的緩沖液、牛血清白蛋白、氯化鈉、吐溫-20、丙三醇、乙二胺四乙酸以及防腐劑組成；

所述的甲氧基去甲腎上腺素-牛血清白蛋白復合體由甲氧基去甲腎上腺素衍生物與牛血清白蛋白偶聯而成，其結構式如式Ⅳ所示：

所述的聚苯乙烯膠乳顆粒直徑范圍為50-250nm；

所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、MES緩沖液、硼酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或巴比妥緩沖液中的一種；

所述促凝劑為PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000或硫酸葡聚糖鈉中的一種；

所述防腐劑為疊氮鈉、硫柳汞、苯酚或乙基汞硫代硫酸鈉中的一種；

所述抗甲氧基去甲腎上腺素特異性抗體為使用甲氧基去甲腎上腺素免疫原對實驗動物進行注射后所得到的特異性抗體，所述的實驗動物為兔子、山羊、綿羊、小鼠、大鼠、豚鼠或馬中的一種；

所述甲氧基去甲腎上腺素免疫原由甲氧基去甲腎上腺素衍生物與載體蛋白連接而成，其結構式如式Ⅱ所示：

其中，載體蛋白為重組牛血清白蛋白；所述重組牛血清白蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

所述的甲氧基去甲腎上腺素衍生物，其結構式如式Ⅰ所示：

2.根據權利要求1所述的應用抗甲氧基去甲腎上腺素特異性抗體制備的甲氧基去甲腎上腺素檢測試劑，其特征在于，所述甲氧基去甲腎上腺素衍生物的合成方法，如下式所示：

反應過程包括以下步驟：

(A1)化合物3合成步驟：將甲氧基去甲腎上腺素、化合物2溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，并加入K₂CO₃進行反應后，經萃取、干燥、濃縮、純化得到化合物3；

(A2)甲氧基去甲腎上腺素衍生物合成步驟：將化合物3與芐基三乙基氯化銨溶解于氯仿中，制成反應溶液；將NaOH溶液滴加入反應溶液中，反應后調節溶液pH＝6，然后經萃取、干燥、濃縮、純化，得到甲氧基去甲腎上腺素衍生物。

3.根據權利要求1所述的應用抗甲氧基去甲腎上腺素特異性抗體制備的甲氧基去甲腎上腺素檢測試劑，其特征在于，所述甲氧基去甲腎上腺素免疫原的制備方法，包括以下步驟：

(B1)載體蛋白溶液的制備：將權利要求1中所述的重組牛血清白蛋白溶解于磷酸鹽緩沖液中，得到載體蛋白溶液；

(B2)甲氧基去甲腎上腺素衍生物溶液的制備：將權利要求1中所述的甲氧基去甲腎上腺素衍生物與二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸鉀緩沖液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺混合，攪拌溶解，得到甲氧基去甲腎上腺素衍生物溶液；

(B3)甲氧基去甲腎上腺素免疫原的合成：將步驟(B2)得到的甲氧基去甲腎上腺素衍生物溶液加入到步驟(B1)得到的載體蛋白溶液中，攪拌反應，經透析純化，得到甲氧基去甲腎上腺素免疫原。

4.根據權利要求1所述的應用抗甲氧基去甲腎上腺素特異性抗體制備的甲氧基去甲腎上腺素檢測試劑，其特征在于，所述抗甲氧基去甲腎上腺素特異性抗體的制備方法，包含以下步驟：

(C1)將權利要求1中所述的甲氧基去甲腎上腺素免疫原用磷酸鹽緩沖液稀釋，得到甲氧基去甲腎上腺素人工抗原溶液，然后將甲氧基去甲腎上腺素人工抗原溶液與等量弗氏完全佐劑混合，對權利要求1中所述的實驗動物進行多點注射；

(C2)3-6周后，再用相同的甲氧基去甲腎上腺素人工抗原溶液與等量弗氏不完全佐劑混合，對上述實驗動物進行多點注射，之后每隔3-6周注射一次，共計注射3-10次；

(C3)對步驟(C2)中完成注射的實驗動物取血，分離純化，得到抗甲氧基去甲腎上腺素特異性抗體。