[發明專利]一種檢測單核細胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門菌的試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 202011107494.5
• 申請日: 2020-10-16
• 公開（公告）號: CN112255397B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 王娟;趙超;郭媛媛;李娟
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;B29C39/02;B29C39/00;B29C33/38;G01N21/64
• 代理公司: 長春眾邦菁華知識產權代理有限公司 22214
• 代理人: 李外

1.一種檢測單核細胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括實時檢測自吸閥分隔式芯片；

所述的實時檢測自吸閥分隔式芯片包括：自吸閥分隔式芯片、單核細胞增多性李斯特菌的FAM染料修飾特異性適配體、副溶血性弧菌的FAM染料修飾特異性適配體、鼠傷寒沙門菌的FAM染料修飾特異性適配體、空白對照FAM染料修飾適配體、HNB染料和氧化石墨烯。

2.根據權利要求1所述的一種檢測單核細胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門菌的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括：

步驟一：自吸閥分隔式芯片的制備

1)模具的制備

使用CorelDRAW X8設計自吸閥區隔式芯片的通道和腔室圖案，然后將其印刷到一塊透明膜上作為掩模，使用旋涂機，將負性光刻膠涂布于硅晶片上，共計涂布兩層，隨后將硅晶片放在掩模下方的單面光刻機上，調整掩模的位置，以使圖案位于晶片的中間，曝光后對硅晶片進行烘烤，最后，用顯影劑沖洗處理過的硅晶片，直至模具圖形完全出現為止，再次對模具進行烘烤，得到模具；

2)自吸閥區隔式芯片的制作

使用三甲基氯硅烷處理模具，將聚二甲基硅氧烷組分預固劑A和交聯劑B混合去除氣泡，倒入模具中，將螺栓和螺母擰到一端齊平，然后將齊平端向下放置在模具的閥門位置，經加熱板烘烤固化后，將聚二甲基硅氧烷從模具表面揭除，使用打孔器對加樣孔進行打孔，最后，對聚二甲基硅氧烷的通道面及玻璃片的表面同時使用等離子體處理，將被處理的平面相互貼合后烘烤固化形成自吸閥區隔式芯片；

步驟二：氧化石墨烯的制備

將石墨粉加入H₂SO₄和硝酸鈉的混合物中，于冰浴中攪拌，劇烈攪拌下，將高錳酸鉀緩慢加入上述混合物，繼續在30～40℃攪拌，然后加熱至140～150℃攪拌，加入去離子水終止反應體系，在冰浴中用氫氧化鈉中和H₂SO₄，將PH調至5.5～6，得到的淺黃色溶液經過離子過濾膜過濾去除大顆粒，然后在透析袋中透析2-3天去除鹽分，得到氧化石墨烯；

步驟三：實時檢測自吸閥區隔式芯片的制備

將閥門關閉，使用透明膠帶覆蓋芯片頂部，置于真空泵中進行脫氣處理，將步驟二得到氧化石墨烯分別與單核細胞增多性李斯特菌的FAM染料修飾特異性適配體、副溶血性弧菌的FAM染料修飾特異性適配體、鼠傷寒沙門菌的FAM染料修飾特異性適配體或空白對照FAM染料修飾適配體和HNB混合，分別通過四個底物進樣孔在負壓條件下使混合物均勻分布到樣品孔中，將上述芯片頂部的膠帶揭除，置于65℃加熱板上干燥，待底物完全干燥后將芯片取下，打開閥門，于芯片頂部用膠帶重新貼附，并置于真空泵中抽真空，獲得實時檢測自吸閥區隔式芯片。

3.根據權利要求2所述的一種檢測單核細胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門菌的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述步驟一中硅晶片烘烤條件是60～70℃烘烤1～3min，隨后是85～95℃下烘烤10min。

4.根據權利要求2所述的一種檢測單核細胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門菌的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述步驟一中三甲基氯硅烷處理時間是10～20min。

5.根據權利要求2所述的一種檢測單核細胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門菌的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述步驟一中聚二甲基硅氧烷組分預固劑A和交聯劑B的質量比10：1。

6.根據權利要求2所述的一種檢測單核細胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門菌的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述步驟一中混合聚二甲基硅氧烷組分去除氣泡的條件是1500～2000rpm旋轉1～2min。

7.根據權利要求2所述的一種檢測單核細胞增多性李斯特菌、副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門菌的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述步驟一中烘烤固化的溫度是70～90℃，時間是30～40min。