[發明專利]一種牙髓干細胞大規模常溫消化方法

有效

• 申請號: 202011106786.7
• 申請日: 2020-10-16
• 公開（公告）號: CN112251401B
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 葉青松;鄭麗娜;楊多佳;賀捷;陳以列;夏蒙婷;賀燕
• 申請（專利權）人: 浙江優牙生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 溫州金甌專利事務所(普通合伙) 33237
• 代理人: 王宏雷

一種牙髓干細胞大規模常溫消化方法,通過比較幾種消化方式對細胞的影響，優化消化方式，在常溫條件下實現大規模消化生產，整個消化操作在生物安全柜中進行，減少細胞污染的風險，操作更加連貫；節省了耗材和培養基用量，降低成本；且無需占用培養箱和顯微鏡；無需離心，提高了細胞的增殖活力；提升了單次處理瓶數；縮短了細胞消化操作時間；提高了牙髓干細胞消化工藝的生產效率。

技術領域

本發明涉及牙髓干細胞技術領域，具體涉及一種牙髓干細胞大規模常溫消化方法。

背景技術

牙髓干細胞是一種存在于人牙髓組織中具有高度增殖能力和多向分化潛能的間充質干細胞，來源豐富、取材安全方便、不涉及倫理學問題、免疫原性低，較其他間充質干細胞更具有優勢，已成功用于牙齒、骨、神經、肌肉、角膜等組織重建及再生等臨床應用研究，在組織工程修復和再生醫學中有廣泛的應用前景。尤其在牙周組織再生方面，“人牙髓間充質干細胞注射液”已獲國家藥品監督管理局藥品審評中心（CDE）臨床默示許可，有望為人類慢性牙周炎的再生治療提供新的治療藥物和方法。

牙髓干細胞作為再生醫學重要的細胞來源之一，體外培養獲得大量質量穩定的干細胞是牙髓干細胞進入臨床應用的前提條件。然而牙髓組織量少，需在體外進行大量擴增得到足量的細胞。牙髓干細胞呈貼壁生長，每擴增一代需進行一次消化。消化是利用消化酶通過在特定位置上降解蛋白，使細胞間結合處蛋白降解，這時細胞在自身內部細胞骨架的張力作用下成為球形，從而使細胞間分離。因而細胞消化是影響細胞生長狀態好壞的關鍵因素之一。

目前牙髓干細胞常規的消化方法，是在生物安全柜中加入胰酶后，放入37℃培養箱進行消化，然后在倒置相差顯微鏡下觀察細胞消化情況，再轉移至生物安全柜中吹打，收集細胞懸液離心去除胰酶，加培養基用于后續培養。在消化過程中，細胞來回進出生物安全柜，人員頻繁走動，增加細胞污染的風險，而且消化過程占用培養箱和顯微鏡，因37℃胰酶作用時間短使得單次處理瓶數有限，消化后需離心去除胰酶，造成一定的細胞損耗和離心對細胞的損傷。

發明內容

針對現有技術存在的缺陷，本發明提供一種牙髓干細胞大規模常溫消化方法，減少細胞污染的風險，操作更加連貫；節省了耗材和培養基用量，降低成本；且無需占用培養箱和顯微鏡；無需離心，提高了細胞的增殖活力；提升了單次處理瓶數；縮短了細胞消化操作時間；提高了牙髓干細胞消化工藝的生產效率。

本發明采用的技術解決方案是：一種牙髓干細胞大規模常溫消化方法，包括以下步驟：

（1）從培養箱中取出具有牙髓干細胞的培養瓶噴酒精后放至生物安全柜；

（2）倒液棄培養基上清液；

（3）加入DPBS清洗培養瓶并倒液棄除；

（4）加入重組胰酶，溫和搖動培養瓶使重組胰酶浸潤細胞后立即棄除重組胰酶；

（5）放倒培養瓶在生物安全柜臺面上，常溫消化至大部分細胞開始皺縮、細胞邊界明顯時，輕輕拍打培養瓶細胞面；

（6）倒入培養基終止消化；

（7）水平方向前后搖晃培養瓶使細胞從培養瓶上脫落，倒液轉移至儲液瓶，用移液管吹打細胞懸液至單細胞，即完成消化。

所述的培養瓶內的牙髓干細胞為傳代的牙髓干細胞。

所述的步驟（4）中棄除重組胰酶采用浸潤后倒液棄除的方式。

所述的步驟（3）中加入DPBS的量為2-10ml。

所述步驟（4）中加入的重組胰酶的量為1-5ml。

所述步驟（5）中常溫消化至大部分細胞開始皺縮、細胞邊界明顯的時間為60-180s。

所述步驟（6）中加入的培養基為5-10ml。