[發(fā)明專利]一種低濃度ROS的檢測方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011106529.3
• 申請日: 2020-10-16
• 公開（公告）號: CN112326607B
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 侯森;俞大良;查英英
• 申請（專利權(quán)）人: 暨南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 廣州市華學知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

本發(fā)明公開了一種低濃度ROS的檢測方法及其應用。本發(fā)明的檢測方法是利用熒光探針DCFH?DA檢測氧化損傷的細胞內(nèi)活性氧ROS水平，包括如下步驟：(1)將氧化損傷的細胞中加入DCFH?DA溶液，避光孵育，移除溶液，沖洗細胞，獲得待測細胞樣品；(2)將待測細胞樣品采用燈光照射，檢測熒光信號值。本發(fā)明的檢測方法可檢測細胞中低劑量的ROS，克服了低劑量ROS的檢測容易受到光輻射的影響，無法準確表達真實ROS水平的問題；采用本發(fā)明的方法可增大不同樣品熒光強度，同時又不會改變其相對熒光強度，達到不同樣品之間熒光強度的等比增大，從而使檢測數(shù)值更加明顯。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物活性檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種低濃度ROS的檢測方法及其應用。

背景技術(shù)

活性氧(ROS)是指生物體內(nèi)與氧代謝有關(guān)的含氧自由基以及非自由基形式存在的具有高活性的副產(chǎn)物，包括超氧陰離子、羥基自由基、過氧化氫等。ROS在生物體內(nèi)參與機體的免疫反應、基因表達調(diào)控以及信號傳導等過程，因此其檢測在許多科學研究中具有重要意義，如氧化應激表征、污染物毒性研究、抗腫瘤藥物開發(fā)等。過量的ROS會對細胞質(zhì)膜、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子造成氧化損傷，而氧化損傷機制是多種污染物的重要致毒機理。因此，通過檢測生物體內(nèi)ROS含量的變化，以表征機體受到的氧化損傷具有重要作用。

ROS性質(zhì)活潑、反應性強、壽命短，且生物體內(nèi)存在多種抗氧化機制，因此其檢測具有一定難度。目前，細胞中ROS的檢測主要采用熒光探針法。熒光探針法憑借其靈敏度高、分辨率高、數(shù)據(jù)易于處理等特點在ROS檢測中得到廣泛的應用。

近年來，DCFH-DA熒光探針法被廣泛用于細胞內(nèi)ROS的檢測。DCFH-DA本身不含熒光，可以自由穿透細胞膜，被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，進而被ROS氧化生成熒光物質(zhì)DCF，通過檢測DCF的熒光強度從而量化細胞內(nèi)活性氧的水平。然而，DCFH-DA熒光探針法在應用中也存在較多的問題，其檢測效果往往受到光照、pH值、細胞色素c、抗氧劑等因素的影響。

據(jù)文獻報道，熒光探針具有光敏性，易發(fā)生自氧化而提高背景熒光強度。MarchesiE等人研究表明，在還原劑存在下，可見光連續(xù)照射DCF會使其還原，進一步產(chǎn)生超氧化物，引發(fā)連鎖反應，使得DCFH進一步被氧化，最終導致DCF熒光信號的自放大。DCF光反應機理見圖1。Afzal M等人研究發(fā)現(xiàn)，DCFH在250、300、330、400、500或600nm波長光照射下，能產(chǎn)生熒光物質(zhì)DCF，從而使結(jié)果不穩(wěn)定。與此同時，Setsukinai K等人發(fā)現(xiàn)熒光顯微鏡的激發(fā)光能光誘導自氧化DCFH-DA而使細胞熒光顯著增強。此外，當細胞內(nèi)ROS無變化時，凋亡細胞通過釋放細胞色素c，催化DCFH與細胞內(nèi)ROS反應來使熒光強度增強。pH值的變化可以影響DCFH-DA探針的裝載效率。研究表明，DCFH-DA在堿性條件下可以被水解生成DCFH，而DCFH無法穿透細胞膜，從而導致探針的含量下降。細胞內(nèi)的抗氧劑可與探針反應，探針被還原形成自由基，影響ROS的檢測。

因此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)手段的缺點與不足，發(fā)明人通過使用熒光染料和光輻射作用，發(fā)明了一種針對低濃度ROS的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種低濃度ROS的檢測方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述檢測方法的應用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種低濃度ROS的檢測方法，是利用熒光探針DCFH-DA檢測氧化損傷的細胞內(nèi)活性氧ROS水平，包括如下步驟：

(1)將氧化損傷的細胞中加入DCFH-DA溶液，避光孵育，沖洗，獲得待測細胞樣品；

(2)將待測細胞樣品采用燈光照射，檢測熒光信號值。

步驟(1)中所述的氧化損傷的細胞是ROS含量低，采用現(xiàn)有的活性氧檢測試劑盒檢測不出ROS含量的細胞。