[發明專利]一種低濃度ROS的檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 202011106529.3
• 申請日: 2020-10-16
• 公開（公告）號: CN112326607B
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發明（設計）人: 侯森;俞大良;查英英
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

1.一種低濃度ROS的檢測方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）在不同程度氧化損傷刺激產生ROS的細胞中加入DCFH-DA溶液，避光孵育，沖洗，獲得待測細胞樣品；

（2）將待測細胞樣品采用燈光照射，檢測熒光信號值，根據不同待測細胞樣品的熒光信號值相對大小，即可判斷不同待測細胞樣品中ROS含量的相對高低；

步驟（1）中所述的不同程度氧化損傷刺激產生ROS的細胞是ROS含量低，采用現有的活性氧檢測試劑盒檢測不出ROS含量的細胞；所述的檢測不出ROS含量是指檢測出的數值與空白背景值相差不大，統計分析出的P值大于0.05，沒有顯著性差異；所述的現有的活性氧檢測試劑盒檢測ROS時DCFH-DA在體系中的終濃度為10 μM；通過如下制備方法得到：將細胞接種至96孔板，每孔15000個細胞，細胞貼壁生長12 h，至匯合度達到50~70%，加入H₂O₂溶液刺激細胞，37℃避光培養30 min，使用1×PBS緩沖液沖洗細胞，去除殘留的刺激物；所用的H₂O₂溶液的濃度為體積比0.03~0.06%；

步驟（1）中所述的DCFH-DA溶液是采用含1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的高糖DMEM無血清培養基稀釋DCFH-DA至濃度為2~10 μM，調節溶液pH至7.0得到；

步驟（1）中所述的避光孵育的時間為15~60 min；

步驟（2）中所述的燈光照射的時間為5~10 min；

步驟（2）中所述的燈光照射的光功率密度為5.43~13.40 mW/cm²。

2.根據權利要求1所述的低濃度ROS的檢測方法，其特征在于，

步驟（1）中所述的DCFH-DA溶液采用高糖DMEM無血清培養基稀釋至濃度為10 μM；

步驟（1）中所述的避光孵育的時間為30 min；

步驟（2）中所述的燈光照射的時間為10 min；

步驟（2）中所述的燈光照射的光功率密度為13.40 mW/cm²。

3.根據權利要求1所述的低濃度ROS的檢測方法，其特征在于，

步驟（1）中沖洗細胞為采用PBS緩沖液沖洗2~3次，去除未進入細胞內的DCFH-DA溶液；

步驟（2）中所述的燈光照射為采用LED燈或日光燈照射；

步驟（2）中所述的檢測熒光信號值為采用多功能酶標儀檢測，檢測熒光信號的激發波長為488nm，發射波長為525nm。

4.根據權利要求1所述的低濃度ROS的檢測方法，其特征在于，所述的接種采用的細胞生長培養基的配置：89mL高糖型DMEM培養基、10 mL胎牛血清、1 mL100×青霉素-鏈霉素雙抗溶液，調節pH至7.0。

5.權利要求1~4任一項所述的低濃度ROS的檢測方法在生物科學研究中的應用。