[發明專利]一種干細胞妊娠紋修復方法

在審

• 申請號: 202011106268.5
• 申請日: 2020-10-16
• 公開（公告）號: CN112190533A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 張興民
• 申請（專利權）人: 濰坊卡多娜生物科技有限公司
• 主分類號: A61K8/99
• 分類號: A61K8/99;A61K8/98;A61K8/67;A61K8/73;A61Q19/00;A61Q19/08;C12N5/0775
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1.一種干細胞妊娠紋修復方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1：制備臍帶間充質干細胞細胞因子上清液；

S2：取S1中的部分臍帶，剪切成若干小段，然后用無菌PBS清洗，直至肉眼不可見血絲；

S3：將S2中的清洗完成后的小段臍帶剪碎移入細胞培養皿中，使用含胎牛血清的α-MEM完全培養基培養，待顯微鏡下細胞鋪滿培養皿面積的80%時，加入胰蛋白酶消化傳代；

S4：當S3中細胞傳至第3代對數生長期時，將部分細胞傳代至干細胞無血清培養基中培養，培養后通過離心機采用低速離心法獲得干細胞無血清培養基上清，然后向干細胞無血清培養基上清中加入連接纖維蛋白，混合即可得到輔助修復溶液備用；

S5：制備脂肪間充質干細胞因子上清液；

S6：將輔助修復溶液、臍帶間充質干細胞細胞因子上清液、脂肪間充質干細胞因子上清液、阿拉伯半乳聚糖、葡萄糖酸鋅、葡萄糖酸銅、抗壞血酸鈉按比例15-20：20-30：10-15：1-3：1-2：1-2：0.1-2均勻混合得到修復產品。

2.根據權利要求1所述的一種干細胞妊娠紋修復方法，其特征在于：所述臍帶間充質干細胞細胞因子上清液制備方法，用組織保護液清洗臍帶組織表面血液，去除表皮和血管組織，取出華通膠清洗后剪成5-20塊狀，平鋪在培養皿內。

3.根據權利要求2所述的一種干細胞妊娠紋修復方法，其特征在于：沿培養皿的邊緣慢慢加入間充質干細胞專用培養液至組織淹沒即可；將培養皿放進CO₂濃度為5%的37℃培養箱進行培養，培養至第3-7天；繼續添加培養液9-11天，之后每1-3天進行一次換液。

4.根據權利要求3所述的一種干細胞妊娠紋修復方法，其特征在于：當培養皿內的細胞融合度達到50%-70%時，往培養皿內加熱消化酶，使得組織脫離培養皿，將組織種于康寧T175培養瓶中，加入30ml培養液繼續培養3-4天，待細胞融合度達到90%時，收集上清液，并對上清液進行離心，去除細胞碎片；離心后的上清液加入15ml的超濾管中進行濃縮，去除多余水分使體積濃縮為原體積的一半，濃縮液過0.22μm濾膜除菌，得到臍帶間充質干細胞細胞因子上清液。

5.根據權利要求2所述的一種干細胞妊娠紋修復方法，其特征在于：所述組織保護液為生理鹽水添加25ug/ml的硫酸慶大霉素和5ug/ml的兩性霉素B配制。

6.根據權利要求4所述的一種干細胞妊娠紋修復方法，其特征在于：所述離心速率為3000轉/分鐘；離心時間為20分鐘。

7.根據權利要求1所述的一種干細胞妊娠紋修復方法，其特征在于：脂肪間充質干細胞因子上清液的制備方法，將脂肪顆粒在900-1200r/min的條件下離心4-8min，分別留取上層脂肪組織和下層細胞A，向脂肪組織中加入質量濃度為0.1％的膠原酶，放入37℃水浴搖床中消化25-35min，然后1800-2200r/min離心4-8min，留取下層細胞B；將下層細胞A和下層細胞B混勻，重懸，再以1800-2200r/min離心4-8min，采用無血清成分培養基重懸細胞后，接種至六孔板培養40-50小時，每三天進行一次換液，培養至20-24天。

8.根據權利要求7所述的一種干細胞妊娠紋修復方法，其特征在于：對培養20-24天后混合細胞群進行鑒定，將鑒定為脂肪間充質干細胞的細胞群進行混合傳代培養，細胞數量達到3×10⁷時，采用無血清培養體系和細胞工廠進行擴大培養，培養3-4天,收集得到脂肪間充質干細胞因子上清液。