[發明專利]特異性表達hMRGPRX4的轉基因大鼠的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202011105579.X
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN112266931B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 李毓龍;趙天軍;雷曉光
• 申請（專利權）人: 海湃泰克（北京）生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發明提供一種特異性表達hMRGPRX4的轉基因大鼠的構建方法及其應用。本發明通過將hMRGPRX4表達在大鼠癢覺神經元中，成功構建出一種人源化大鼠，具體方法包括：分別構建轉基因大鼠品系hMRGPRX4?Cre和lsl?hMRGPRX4?mScarlet，并將兩個轉基因大鼠品系進行交配，得到特異性表達hMRGPRX4的轉基因大鼠。本發明為研究hMRGPRX4的功能和篩選靶向hMRGPRX4的抗瘙癢藥物提供了動物模型。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種特異性表達hMRGPRX4的轉基因大鼠的構建方法及其應用。

背景技術

慢性肝病患者常伴有難以忍受的瘙癢，高達60％的原發性膽汁性膽管炎(Primarybiliary cholangitis,PBC)患者有慢性瘙癢的癥狀，嚴重影響患者的生活質量。但目前仍然缺乏緩解或治療該瘙癢的有效藥物。最近研究表明，人源MRGPRX4介導膽酸引起的膽汁淤積性瘙癢。膽酸(cholic acid,CA)及其衍生物可以激活hMRGPRX4；患有瘙癢癥狀的慢性肝病患者血清中膽酸含量顯著高于正常人；膽酸以及hMRGPRX4的激動劑可以在健康人皮膚中引起明顯的瘙癢。因此，hMRGPRX4是治療人膽汁淤積性瘙癢的藥物靶點，hMRGPRX4的拮抗劑將是治療這類瘙癢的備選藥物。

目前開發治療瘙癢藥物面臨的技術瓶頸主要在于，人與模式動物的癢覺感受存在分子機制的差異，使其缺乏有效的動物模型。因此，動物實驗中應用有效的藥物在轉向臨床用于人類時往往無效。這種藥物療效的差異導致昂貴的臨床前和臨床研究失敗。因此，特異性靶向人源蛋白/受體開發治療疾病的藥物將是今后藥物開發的趨勢。此外，對于開發治療人膽汁淤積性瘙癢的藥物，由于MRGPRX4是靈長類特有的受體，在小鼠和大鼠中均沒有功能同源的基因²，因此無法通過傳統的遺傳學方法，比如基因敲除，在模式動物中研究此基因的功能，以及在體篩選備選藥物。

因此，亟需建立合適的動物模型用于在體研究hMRGPRX4的功能，篩選和驗證hMRGPRX4拮抗劑對瘙癢的抑制作用，鑒定引起瘙癢的膽酸類似物，以及篩選降低瘙癢副作用的膽酸衍生物。

發明內容

本發明的目的是提供一種特異性表達hMRGPRX4(人源MRGPRX4)的轉基因大鼠的構建方法及其應用。

本發明的技術原理：人源膽酸受體MRGPRX4可以介導膽汁淤積性瘙癢；大鼠的MrgA受體標記大鼠DRG癢覺神經元；通過MRGPRX4激活大鼠DRG癢覺神經元可以引起瘙癢。本發明利用CRISPR-Cas9基因敲入技術，構建特異性表達hMRGPRX4的轉基因大鼠模型。此模型可以用于研究hMRGPRX4介導癢覺感受的功能，篩選并驗證hMRGPRX4的拮抗劑，開發用于治療膽汁淤積性瘙癢的藥物。

為了實現本發明目的，第一方面，本發明提供一種特異性表達hMRGPRX4的轉基因大鼠的構建方法，包括：

A、構建CRISPR-Cas9系統介導的大鼠MrgA基因敲除且定點整合外源基因①的轉基因大鼠品系I；其中，所述外源基因①是hMRGPRX4基因和重組酶基因之間通過P2A自切割肽段序列(5′-GCCACCAACTTCAGCCTGCTCAAGCAGGCCGGAGATGTGGAAGAGAACCCCGGCCCT-3′)連接而成，且所述CRISPR-Cas9系統靶向MrgA陽性的大鼠DRG神經元細胞；

B、構建CRISPR-Cas9系統介導的大鼠Rosa26基因敲除且定點整合外源基因②的轉基因大鼠品系II；其中，所述外源基因②是hMRGPRX4基因和熒光報告基因之間通過iP2A自切割肽段序列(5′-GCGACGAATTTTAGTCTACTGAAACAAGCGGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT-3′)連接而成，所述外源基因②由CAG啟動子驅動，且在所述CAG或CMV啟動子(也可以使用其它強啟動子)啟動子與外源基因之間包含一段受步驟A中所述重組酶條件性控制的STOP序列；其中，CAG啟動子的序列如SEQ ID NO:4所示。