[發(fā)明專利]特異性表達(dá)hMRGPRX4的轉(zhuǎn)基因大鼠的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011105579.X
• 申請(qǐng)日: 2020-10-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112266931B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李毓龍;趙天軍;雷曉光
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 海湃泰克（北京）生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/65;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

1.特異性表達(dá)hMRGPRX4的轉(zhuǎn)基因大鼠的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

A、構(gòu)建CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的大鼠MrgA基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因①的轉(zhuǎn)基因大鼠品系I；其中，所述外源基因①是hMRGPRX4基因和重組酶Cre基因之間通過(guò)P2A自切割肽段序列連接而成，且所述CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向MrgA陽(yáng)性的大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞，且CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向位點(diǎn)位于MrgA基因內(nèi)含子1和外顯子2處；

B、構(gòu)建CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的大鼠Rosa26基因敲除且定點(diǎn)整合外源基因②的轉(zhuǎn)基因大鼠品系II；其中，所述外源基因②是hMRGPRX4基因和熒光報(bào)告基因之間通過(guò)iP2A自切割肽段序列連接而成，所述外源基因②由CAG或CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，且在所述CAG啟動(dòng)子與外源基因之間包含一段受步驟A中所述重組酶條件性控制的STOP序列；

C、將品系I與品系II大鼠進(jìn)行交配，得到特異性表達(dá)hMRGPRX4的轉(zhuǎn)基因大鼠；

其中，所述hMRGPRX4基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述STOP序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟A中g(shù)RNA作用位點(diǎn)的DNA序列為5′-TCCGGTTAGGAGTAAATTCC-3′和5′-TGAGACAGCGGAAAACACGG-3′；和/或

步驟B中g(shù)RNA作用位點(diǎn)的DNA序列為5′-GACTCCAGTTGCAGATCACG-3′。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中所述熒光報(bào)告基因編碼紅色熒光蛋白mScarlet。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟A包括：根據(jù)大鼠MrgA基因序列，構(gòu)建基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的gRNA和Cas9表達(dá)載體，分別體外轉(zhuǎn)錄得到gRNA和Cas9 mRNA，并根據(jù)gRNA作用位點(diǎn)構(gòu)建含有外源基因①的且可以整合至宿主基因組中的供體質(zhì)粒，然后將體外轉(zhuǎn)錄得到的Cas9 mRNA、gRNA和供體質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入野生型大鼠的受精卵中，然后將克隆胚胎通過(guò)非手術(shù)法移入大鼠子宮內(nèi)進(jìn)行妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因大鼠。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B包括：根據(jù)大鼠Rosa26基因序列，構(gòu)建基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的gRNA和Cas9表達(dá)載體，分別體外轉(zhuǎn)錄得到gRNA和Cas9 mRNA，并根據(jù)gRNA作用位點(diǎn)構(gòu)建含有外源基因②的且可以整合至宿主基因組中的供體質(zhì)粒，然后將體外轉(zhuǎn)錄得到的Cas9 mRNA、gRNA和供體質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入野生型大鼠受精卵中，然后將克隆胚胎通過(guò)非手術(shù)法移入大鼠子宮內(nèi)進(jìn)行妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因大鼠。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟A和B中所述hMRGPRX4基因的3’端帶有3×Flag標(biāo)簽序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述大鼠為SD大鼠。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述方法構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因大鼠的以下任一應(yīng)用：

(1)用作篩選治療或緩解人膽汁淤積性瘙癢癥藥物的動(dòng)物模型；

(2)用于篩選治療或緩解人膽汁淤積性瘙癢癥的藥物；

(3)用于檢測(cè)引起人膽汁淤積性瘙癢癥的物質(zhì)；

(4)用于篩選hMRGPRX4受體的激動(dòng)劑或抑制劑；

(5)用于hMRGPRX4基因功能的研究。

9.提高h(yuǎn)MRGPRX4基因在大鼠MrgA陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)量的方法，其特征在于，包括：將轉(zhuǎn)基因大鼠品系I與轉(zhuǎn)基因大鼠品系II進(jìn)行交配；

其中，所述轉(zhuǎn)基因大鼠品系I、轉(zhuǎn)基因大鼠品系II同權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述。