[發明專利]牛擴展多能性胚胎干細胞的建系方法及培養液

在審

• 申請號: 202011105397.2
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN114369567A
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 李喜和;趙麗霞;王子馨;包斯琴;劉澎濤;曹貴芳
• 申請（專利權）人: 內蒙古大學;內蒙古賽科星家畜種業與繁育生物技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種牛擴展多能性胚胎干細胞的建系方法，其特征在于，取牛體外受精后第六天胚胎，用BO-WASH培養基沖洗兩次，接種于提前解凍好的牛成纖維細胞的飼養層細胞上，在添加10μM Y-27632的細胞因子培養液培養；第5天后觀察細胞長出，換成細胞因子培養液；隔天換液，第12到14天構建成牛擴展多能性胚胎干細胞系，其中，Y-27632結構式為：

2.根據權利要求1所述的牛擴展多能性胚胎干細胞的建系方法，其特征在于，所述飼養層細胞的制備方法為：解凍牛成纖維細胞，待細胞匯合度達到80％以上，按照1：16進行細胞傳代；待細胞的匯合度再次達到80％時，添加10μg/ml的絲裂霉素于培養箱中培養2.5-3h；胰酶消化后用牛成纖維細胞培養液中止消化，離心并去上清，用含10％DMSO、10％胎牛血清和80％牛成纖維細胞培養液的培養液重懸并凍存為飼養層細胞。

3.根據權利要求2所述的牛擴展多能性胚胎干細胞的建系方法，其特征在于：所述牛成纖維細胞培養液是在DMEM培養基中，添加10％胎牛血清，1×谷氨酰胺，1×非必需氨基酸，1×青鏈霉素。

4.根據權利要求1-3任一所述的牛擴展多能性胚胎干細胞的建系方法，其特征在于：所述牛種類選自乳用品種、肉用品種、兼用品種或役用品種。

5.根據權利要求1-3任一所述的牛擴展多能性胚胎干細胞的建系方法，其特征在于，所述細胞因子培養液包括：(1)有效量的成纖維細胞生長因子或其等效物；(2)有效量的一種或多種Wnt信號通路抑制劑；(3)有效量的GSK-3α/β信號通路抑制劑；(4)有效量的Lck/Src信號通路抑制劑；(5)有效量的Activin A蛋白或其等效物。

6.根據權利要求5所述牛擴展多能性胚胎干細胞的建系方法，其特征在于，所述Wnt信號通路抑制劑為IWR-1、XAV-939、ICG-001、Wnt-C59、LGK-974、LF3、CP21R7、NCB-0846、PNU-74654SKL2001、KY02111、IWP-2、IWP-L6、FH535、WIKI4、PRI-724、IQ-l、KYA1797K、C59、ETC-159、G007-LK、G244-LM中的一種或多種。

7.根據權利要求5所述牛擴展多能性胚胎干細胞的建系方法，其特征在于，所述GSK-3α/β信號通路抑制劑為CHIR99021、B216763、AT7519、CHIR-98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、2-D08、6-溴靛玉紅-3'-丙酮肟(BIO-acetoxime)、IM-12、1-氮雜坎帕羅酮(1-Azakenpaullone)、靛玉紅(Indirubin)或ATP抑制劑Bikinin。

8.根據權利要求5所述牛擴展多能性胚胎干細胞的建系方法，其特征在于，所述Lck/Src信號通路抑制劑為WH-4-023、達沙替尼(Dasatinib)、塞卡替尼(Saracatinib)、普納替尼(Ponatinib)、SKI-606，Src抑制劑KX2-391(Tirbanibulin)、NVP-BHG712、PP2或PP121。

9.一種權利要求1-3任一所述牛擴展多能性胚胎干細胞建系方法用細胞因子培養液，其特征在于，所述細胞因子培養液的組成為：

mTeSR^TM1

100X 青鏈霉素

0.1mM 2-巰基乙醇

1μM CHIR99021

0.3μM WH-4-023

5μM XAV939 or 5μM IWR-1

50μg/ml vitamin C

10ng/ml LIF

20.0ng/ml Activin A

其中，IWR-1結構式為：

CHIR99021結構式為：

WH-4-023結構式為：

XAV939結構式為：