[發明專利]一種調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株及應用和方法

在審

• 申請號: 202011102557.8
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN112430550A
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發明（設計）人: 馬文建;周颯;陳洪冉;宋玉鵬;劉慶喜;劉心怡;馬寧
• 申請（專利權）人: 天津科技大學;齊魯理工學院
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/90;C12N15/54;C12Q1/02;C12Q1/6897;C12R1/865
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

本發明涉及一種調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株構建方法，步驟如下：構建KanMX?GPD?Degron?RAD51表達框，使用醋酸鋰化學轉化法將表達框轉化到已敲除RAD27基因的釀酒酵母細胞中，構建由Degron控制RAD51表達的突變菌株。溫度升高至37℃時，菌株中RAD51表達的蛋白被瞬時降解，使菌株協同致死。本發明利用簡單快捷的方式構建協同致死基因菌株，在敲除一個協同基因的基礎上，利用可誘導的蛋白降解控制另一個協同基因，瞬時降解必需蛋白，從而研究潛在的基因協同及互補關系。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其是一種調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株及應用和方法，是一種通過溫度、光或化學因子調控蛋白降解，來誘導基因協同致死，以及研究基因間相互作用的技術。

背景技術

如果兩個基因功能具有互補性，單個基因缺失對細胞生長影響不大，而同時缺失(或突變)時則會導致細胞死亡，此稱為協同致死(synthetic lethal)。研究基因間協同致死的分子機制不僅具有重要的生物學基礎理論意義，更是藥物開發的熱點領域。例如，基于眾多癌細胞的DNA修復缺陷，研究DNA修復途徑間互補關系，利用特定蛋白抑制劑來阻斷對癌細胞必需而正常細胞可耐受的DNA修復途徑，即可特異性殺死癌細胞，這是臨床放療和化療的基礎，并被廣泛用于開發腫瘤靶向藥物，以及探索新的精準醫療策略。

在醫藥研發領域，協同致死的實現，最常用的是通過蛋白抑制劑。這是一類小分子化合物，可與蛋白分子活性中心上的一些基團結合，使蛋白活力下降，甚至消失。一個廣為人知的例子是PARP抑制劑–它是一種靶向聚ADP核糖聚合酶(PARP)，抑制其活性的藥物。這是第一種成功利用協同致死原理并獲得批準在臨床使用的抗癌藥物。自2014年以來，已先后被美國FDA和歐洲EMA批準用于治療攜帶BRCA基因突變的乳腺癌、卵巢癌和前列腺患者，數種藥物目前也已在中國獲批。

協同致死亦可通過RNA干擾的方式來實現。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發的mRNA高效特異性降解的現象。通過DNA修飾以及染色體異染色質化等原因使基因不能正常轉錄，或者通過啟動細胞質內靶向mRNA序列的特異性的降解機制，來干擾基因轉錄水平，從而影響蛋白的表達，間接達到基因協同致死的目的。

然而，進行基因間互補關系和合成致死的基礎研究，使用蛋白抑制劑或RNAi均面臨一些困難：

1、研究基因間的互補關系，需要篩選大量相關基因，而特異性蛋白抑制劑種類很少，研發困難，遠遠不能進行全基因覆蓋。

2、RNA干擾不能確保目的基因表達被完全抑制；會出現非特異性基因沉默；同時，因產生抑制所需的時間較長，細胞會激活替代通路，產生適應及耐受性等問題。

本發明提供了一種利用degron誘導蛋白降解來研究基因協同致死的方法。Degron譯稱‘降解決定子’，最初在植物中發現的，是激素控制的降解蛋白質的一種機制，通過E3泛素化機制完成。鑒于泛素化蛋白降解機制廣泛存在于各種生物體中，利用其可建立一種通過溫度、光或化學因子調控的、誘導蛋白快速降解的方法，稱為Degron系統。盡管Degron系統在研究單個基因/蛋白功能方面有很多應用，但將其應用于基因的協同致死，特別是腫瘤治療，尚未見報道。

通過檢索，尚未發現與本發明專利申請相關的專利公開文獻。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株及應用和方法，該菌株在構建時利用已有的蛋白降解技術，通過基因改造構建通用酵母菌株(或人體細胞)，來實現可潛在用于腫瘤治療的基因協同致死及篩查功能互補的細胞信號通路。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株，構建步驟如下：