[發明專利]一種調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株及應用和方法

在審

• 申請號: 202011102557.8
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN112430550A
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發明（設計）人: 馬文建;周颯;陳洪冉;宋玉鵬;劉慶喜;劉心怡;馬寧
• 申請（專利權）人: 天津科技大學;齊魯理工學院
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/90;C12N15/54;C12Q1/02;C12Q1/6897;C12R1/865
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

1.一種調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株，其特征在于：構建步驟如下：

首先，分別擴增篩選標記基因KanMX、啟動子GPD、已報道的溫控Degron工作元件、目的基因RAD51，利用重疊延伸PCR技術將四個目的片段連接成一個完整表達框；

然后，使用醋酸鋰化學轉化法將表達框轉化到已敲除RAD27基因的釀酒酵母細胞中，利用其自身同源重組使表達框整合到酵母染色體特定位點，成功構建由Degron控制RAD51表達的突變菌株。

2.根據權利要求1所述的調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株，其特征在于：所述重疊延伸PCR設計引物時，引物互補重疊部分大于15bp。

3.根據權利要求1所述的調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株，其特征在于：所述篩選標記基因KanMX的引物為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，所述啟動子GPD的引物為SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4，所述Degron工作元件的引物為SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，所述目的基因RAD51的引物為SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。

4.根據權利要求1所述的調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株，其特征在于：所述重疊延伸PCR時分為兩部分進行，第一步將之前純化所得PCR產物進行混合使其互為模板及引物，加入dNTP及Pfu酶進行PCR，退火溫度為50-54℃，進行PCR5-10輪即可；

第二步取PCR產物做為模板，加入引物F及R進行PCR，退火溫度為54-58℃，擴增出完整的表達框基因。

5.根據權利要求1至4任一項所述的調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株，其特征在于：所述構建的由Degron控制RAD51表達的突變菌株在正常培養條件下能夠存活，當溫度升高至37℃時，菌株中RAD51表達的蛋白被瞬時降解，從而使兩個協同致死基因同時失去作用，使菌株發生了協同致死。

6.根據權利要求1至4任一項所述的調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株，其特征在于：所述構建的由Degron控制RAD51表達的突變菌株，由于RAD51基因與RAD27基因同時失去作用時，菌株無法存活，所以在不啟動Degron時，只有RAD27基因缺失，但是RAD51正常表達，菌株能夠正常存活。

7.如權利要求1至6任一項所述的調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株在研究基因協同作用方面中的應用。

8.如權利要求1至6任一項所述的調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株在協同致死基因靶點篩查方面中的應用。

9.利用如權利要求1至6任一項所述的調控蛋白降解誘導基因協同致死的菌株研究基因協同作用的方法，其特征在于：步驟如下：

接種突變菌株于YPDA培養基，28℃搖床培養，根據實驗要求進行處理細胞，在需要研究基因協同作用時，提高溫度至37℃時，瞬時降解RAD51蛋白，從而達到協同基因同時缺失，而細胞存活的條件，進而提供腫瘤治療相關基因靶點的篩查實驗條件。