[發明專利]產2’-巖藻糖基乳糖的基因工程菌及其應用

在審

• 申請號: 202011102427.4
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN112342176A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 張濤;江波;李夢麗;李晨晨
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N9/90;C12N9/38;C12N9/12;C12N9/10;C12N9/04;C12P19/00;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明涉及產2’?巖藻糖基乳糖的基因工程菌及其應用，屬于代謝工程和食品發酵技術。本發明通過改變大腸桿菌中轉錄調控因子的表達來調控代謝路徑中的磷酸甘露糖變位酶，甘露糖?1?磷酸鳥嘌呤基轉移酶、GDP?甘露糖?6?脫氫酶、GDP?巖藻糖合成酶、α?1,2?巖藻糖基轉移酶和乳糖通透酶的表達水平，以獲得最佳質粒組合；通過CRISPR?Cas9基因編輯系統敲除大腸桿菌合成途徑中的β?半乳糖苷酶和UDP?葡萄糖脂質載體轉移酶，以提高2’?巖藻糖基乳糖的累積量；本發明得到的重組大腸桿菌可以利用甘油或葡萄糖合成2’?巖藻糖基乳糖，遺傳穩定，表達水平高，具有明顯的工業化生產潛力。

技術領域

本發明涉及產2’-巖藻糖基乳糖的基因工程菌及其應用，屬于代謝工程和食品發酵技術。

背景技術

人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)是母乳中僅次于脂肪和乳糖的第三大固體成分。巖藻糖基化的HMOs，包括2’-巖藻糖基乳糖(2’-FL),3-巖藻糖基乳糖(3-FL)，乳酰-N-四糖，乳酰-N-新四糖，乳酰-N-巖藻戊糖，這些物質作為天然的抗粘附劑，通過防止病原體附著，降低嬰幼兒由空腸彎曲桿菌、大腸桿菌和肺炎鏈球菌等有害菌引起的胃腸道、泌尿生殖系統和呼吸道感染的風險。2’-FL是母乳中分泌最豐富的人乳寡糖，約占總HMOs的30％，有研究表明，配方奶粉中添加2’-FL喂養的嬰兒，其體內的腸道菌群種類與母乳喂養的嬰兒一致。目前，歐盟，美國和中國已批準2’-FL作為新食品成分使用，且對其安全性、適用性以及使用劑量等進行了規范。

2’-FL的生產可采用母乳分離、化學合成、酶法合成和微生物發酵。因母乳來源有限及化學合成過程需精準地對側鏈保護和脫保護，過程繁瑣，無法實現2’-FL的高效合成。酶法合成2’-FL，可根據受體和糖基供體的構型篩選合適的酶類，但是核苷供體GDP-巖藻糖的價格昂貴，且酶的催化活力低，產量僅有毫克級別，無法實現大規模的工業化生產。隨著合成生物學和代謝工程等技術手段的發展，利用微生物生產2’-FL備受關注，當前，研究較多的是以大腸桿菌為模式生物，通過從頭合成途徑和補救途徑代謝生產GDP-巖藻糖，在此基礎上異源表達α-1,2巖藻糖基轉移酶，最終發酵得到2’-FL。

大腸桿菌由于生長迅速、培養簡單、重組子穩定、載體受體系統完備等特點，是作為GDP-巖藻糖合成研究的理想模式微生物。在從頭合成途徑中，工程菌可直接利用廉價的底物(甘油或葡萄糖)實現關鍵前體GDP-巖藻糖的高效合成，進而為2’-FL的工業制備提供了有利條件。本發明旨在利用合成生物學手段，基于從頭合成路徑構建高效制備2’-FL的重組大腸桿菌，根據不同拷貝數的質粒組合實現代謝模塊的優化。利用CRISPR-Cas9基因敲除技術弱化副代謝分支酶，有效提高了2’-FL的產量。該方法為2’-FL的批量生產提供了有效途徑，同時具有較強的理論研究價值和社會經濟效益，市場開發前景廣闊。

發明內容

針對現有2’-巖藻糖基乳糖合成產率低，糖苷供體昂貴等問題，本發明提供了一種利用基因工程手段改造大腸桿菌的方法，敲除了2’-巖藻糖基乳糖分解代謝的相關基因，強化了從頭合成途徑的關鍵合成酶，該重組菌可利用廉價底物高效制備2’-巖藻糖基乳糖，具有廣泛的工業應用價值。

本發明提供了一種生產2’-巖藻糖基乳糖的工程菌，所述工程菌敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂質載體轉移酶基因wcaJ，并過表達了磷酸甘露糖變位酶manB、甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉移酶manC、GDP-甘露糖-6-脫氫酶gmd、GDP-巖藻糖合成酶wcaG、α-1,2巖藻糖基轉移酶futC和乳糖通透酶lacY。

在本發明的一種實施方式中，利用啟動子T7或tac對基因進行過表達。

在本發明的一種實施方式中，利用pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1或pCOLADuet-1對上述至少一個基因進行過表達。