[發明專利]一種痰液液化方法及其專用液化試劑

在審

• 申請號: 202011101631.4
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN114369646A
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 趙雁林;歐喜超;趙冰;劉東鑫;賀文從;何萍;王怡婷
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/02;C12R1/32
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 葉占洋;魯兵

本發明公開了一種痰液液化方法及其專用液化試劑，屬于生物技術方法領域。該痰液液化方法包括將痰液液化試劑與痰液樣本混勻后進行高溫處理或高溫與超聲聯用處理，一步操作就可以實現痰液徹底液化和從病原體中釋放核酸，并同時長效保護病原體核酸不被降解的目的，操作簡單方便，耗時短，可以極大提高痰液樣本的液化效率，并可以顯著提高陽性檢出率。該痰液液化試劑組成簡單，且各組分濃度較低，可以極大降低生產成本。

技術領域

本發明屬于生物技術方法領域，具體涉及一種痰液液化方法及其專用液化試劑。

背景技術

核酸檢測是病原體檢測的重要方法之一，目前的病原體核酸檢測分為兩類，一類是以DNA為檢測靶標，一類是以RNA為檢測靶標。DNA在病原體中的拷貝數一般較低，而RNA在病原體中的拷貝數較高，特別是核糖體RNA，一個病原體中可以有成百上千甚至上萬個RNA靶標拷貝，因此以病原體的RNA為靶標的病原體檢測方法可以提高病原體的檢出率。但是由于RNA極易降解的特點，一旦病原體死亡，RNA會快速降解掉，從而無法檢測到病原體。

痰液中的病原體檢測是呼吸道疾病檢測的重要方式，痰是人體呼吸道的分泌物，它是通過支氣管上皮纖毛的運動，從肺部向上呼吸道推動，最后，通過人的正常咳嗽反射從氣管內咳出排出體外。正常人痰很少，只是保持呼吸道濕潤而分泌的少量粘液。當人吸入刺激性氣體、塵埃、致病細菌、病毒等有害微生物時，上呼吸道就可能發生炎癥；或者肺部發生疾病，如支氣管擴張、肺膿腫、肺癌等，呼吸道痰液就會分泌增加，痰液中包含多種病原微生物、各類炎癥細胞、脫落壞死的黏膜上皮細胞以及腫瘤細胞等。通過檢測痰液樣本中病原體的核酸來鑒定病原體的種類是目前較精準且最快速的呼吸道病原體診斷方法之一。隨著實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(Simultaneous Amplification and Testing，簡稱SAT)在病原體檢測領域的快速發展，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、檢測迅速、檢出率高等特點，該技術已逐漸在臨床診斷領域占據重要地位。

然而，痰液樣本包含粘蛋白和其他多種蛋白、多種酶類、脫落細胞、微生物及其他吸入雜質等，具有粘度高、蛋白多、成分復雜等特點，利用其直接進行核酸檢測會很困難，因此需要對痰液樣本進行液化降低粘度并安全釋放出病原體中的核酸而不被降解，減少多種核酸檢測抑制物的干擾。目前常見的痰液液化方法為氫氧化鈉法(例如CN106867998A、CN104988237A所述)、DTT(二硫蘇糖醇)法(例如，何慧等“不同液化處理及核酸共提取方法對痰樣本中病毒核酸的提取效果比較”，國際流行病學傳染病學雜志，2016年4月第43卷第2期中所述)、蛋白酶法(例如CN104232621A所述)、蛋白酶法和DTT的組合方法(例如CN108048450A所述)以及由胍類和半胱氨酸衍生物等組成的痰液液化試劑(例如CN108949748A所述)。其中，氫氧化鈉法是最常用的痰液液化方法，該方法比較簡單，利用主成分為一定濃度的氫氧化鈉溶液即可液化痰液。然而，該方法用于痰液樣本液化時，會使痰液中大部分病原體快速死亡從而導致RNA降解，最終導致病原體RNA的檢出率偏低，且該液化方法得到的液化樣本難以直接用于后續的病原體核酸檢測，往往需要在液化后先富集病原體沉淀，再進行核酸提取，操作比較復雜，而且很多對氫氧化鈉溶液耐受性較低的病原體痰液樣本并不適用該種液化方法。蛋白酶法的原理是利用蛋白酶消化痰液粘蛋白，該方法所需蛋白酶成本較高，且酶解反應耗時較長(一般37～65℃保溫1～5小時)，容易液化不均，且效率低。DTT法是利用含巰基(-SH)的DTT斷裂痰液中導致粘稠的主要成分粘蛋白，該方法需要使用高濃度的DTT，耗時長，且往往需要離心操作，并且由于DTT穩定性差，需要在低溫條件下保存，經該方法液化后的痰液經常液化不均，且很容易從溶液狀態轉變為凝膠狀態，且DTT具有一定的毒性，不適合臨床上液化痰液樣本時高濃度使用。蛋白酶法和DTT法的組合方法可以在一定程度上減少經液化后溶液狀態的痰液向凝膠狀態轉變，但是該方法仍需要使用成本較高的蛋白酶和較高濃度的DTT，且成分復雜，由于使用蛋白酶液化痰液時需要在常溫或以上溫度條件下進行長時間的孵育操作，而DTT穩定性差需要低溫保存，因此蛋白酶液化操作和DTT液化操作必須分步進行，從而也導致該方法操作繁瑣，耗時較長，液化效率較低，并且還可能需要進行離心等操作，不適合用于臨床上液化直接進行核酸檢測的痰液樣本。由胍類和半胱氨酸衍生物等組成的痰液液化試劑雖然可以在常溫條件下長效保護樣本中的核酸，但是并不適合用于對高溫處理條件下裂解病原體釋放的核酸進行有效保護，從而會造成陽性檢出率偏低。