[發明專利]一種環糊精葡萄糖基轉移酶突變體及其構建方法

有效

• 申請號: 202011101602.8
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN112301012B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 吳敬;王蕾;孔德民
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12P19/18;C12P19/04;C12P19/44;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種環糊精葡萄糖基轉移酶突變體及其構建方法，屬于基因工程和酶工程領域。本發明將來源于Bacillus stearothermophilus NO2的環糊精葡萄糖基轉移酶進行突變，得到了歧化水解比以及歧化反應催化效率提高的突變體；其中，突變體L277M/G282A的歧化活力與水解活力比值與野生型環糊精葡萄糖基轉移酶歧化活力與水解活力的比值相比，提高了183.33％；突變體L277F、G282A、L277F/G282A的歧化反應催化效率與野生酶相比有所提高，分別是野生酶的1.128倍、1.186倍和1.253倍；采用本發明所構建的突變體能夠降低生產成本，適于工業化生產。

技術領域

本發明涉及一種環糊精葡萄糖基轉移酶突變體及其構建方法，屬于基因工程和酶工程領域。

背景技術

環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase，EC 2.4.1.19)屬于α-淀粉酶家族(糖苷水解酶13_2，GH13_2)，能夠以淀粉、麥芽糊精等為底物催化轉糖苷反應以及水解反應。其中，轉糖苷反應包括歧化反應、環化反應及偶合反應。歧化反應是兩個不同分子間發生的轉糖苷反應，環化反應是分子內發生的轉糖苷反應，偶合反應是環化反應的逆反應。在實際應用中，常利用CGTase歧化反應生成多種水溶性、穩定性提高的糖苷化合物，如L-抗壞血酸、橙皮苷、柚皮苷的糖基化產物。然而，已發現的所有天然來源的CGTase均同時具有歧化和水解活性，水解反應作為副反應會降低轉糖苷產物的產量；因此，在工業生產中CGTase的水解活性應該盡可能的降低。

目前，CGTase很難進一步提高其歧化反應效率，大多數的突變體不能同時兼顧提高歧化活力和降低水解活力，歧化水解比或歧化反應效率的提高可以有效的提高產量，是工業生產中需要解決的一大難題。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，本發明通過對來源于Bacillusstearothermophilus NO2的環糊精葡萄糖基轉移酶進行改造，以獲得歧化水解比或歧化反應催化效率提高的突變體，將突變體應用于工業生產。

本發明提供一種環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體，所述環糊精葡萄糖基轉移酶突變體是通過將出發氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的環糊精葡萄糖基轉移酶的第277位氨基酸進行突變得到的；

或者，所述環糊精葡萄糖基轉移酶突變體是通過將出發氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的環糊精葡萄糖基轉移酶的第282位氨基酸進行突變得到的；

或者，所述環糊精葡萄糖基轉移酶突變體是通過將出發氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的環糊精葡萄糖基轉移酶的第277位氨基酸和第282位氨基酸同時進行突變得到的。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體為以下(a)～(d)任一：

(a)將出發氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的環糊精葡萄糖基轉移酶的第277位的由亮氨酸突變為苯丙氨酸，并命名為L277F，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)將出發氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的環糊精葡萄糖基轉移酶的第282位的由甘氨酸突變為丙氨酸，并命名為G282A，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(c)將出發氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的環糊精葡萄糖基轉移酶的第277位和第282位由亮氨酸和甘氨酸分別突變為甲硫氨酸和丙氨酸，并命名為L277M/G282A，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(d)將出發氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的環糊精葡萄糖基轉移酶的第277位和第282位由亮氨酸和甘氨酸分別突變為苯丙氨酸和丙氨酸，并命名為L277F/G282A，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本發明的一種實施方式中，所述環糊精葡萄糖基轉移酶來源于Bacillusstearothermophilus NO2，編碼所述環糊精葡萄糖基轉移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。