[發明專利]一種細胞全懸浮馴化方法、DF-1細胞全懸浮馴化方法及應用

在審

• 申請號: 202011101175.3
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN112210530A
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發明（設計）人: 王洪林;劉志亮;范娜娜;孫友君;宋桂才;張恒;盧博;王稼林;馬廣斌;鹿洪偉;鄒海濤
• 申請（專利權）人: 山東信得動物疫苗有限公司;山東諸子生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/02;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 于晶晶

本發明公開一種細胞全懸浮馴化方法、DF?1細胞全懸浮馴化方法及應用，本發明將在含血清培養基中貼壁培養的貼壁培養型細胞直接轉到無血清培養基中懸浮培養，培養幾代后再次用含血清培養基進行貼壁培養，如此反復多次培養后即可獲得全懸浮培養型細胞，該方法成功的馴化出了全懸浮DF?1細胞，本發明的DF?1細胞全懸浮馴化方法應用于禽源病毒疫苗的研發和生產中，極大地降低了疫苗生產過程中的污染風險和疫苗的生產成本，同時也能夠保證病毒的效價，在實際生產中具有潛在的優勢和巨大的應用價值，對疫苗的規模化生產具有重要的意義。

技術領域

本發明屬于細胞馴化方法技術領域，具體地說涉及一種細胞全懸浮馴化方法、DF-1細胞全懸浮馴化方法及應用。

背景技術

DF-1細胞為鴨成纖維細胞系，其作為永生化的傳代細胞系廣泛用于培養繁殖雞法氏囊病毒。雞法氏囊病毒感染是主要引起肉仔雞的一種病毒性傳染病。2015年以來該病在國內廣泛流行，對3—5周齡肉雞的致死率高達40％～100％，給我國養禽業造成了巨大的經濟損失。

傳統的DF-1細胞培養大多采用血清貼壁的方式，該培養方式工藝復雜，占地面積大，需大量人工操作并且在培養過程中需要添加血清，增加了被外源病毒、支原體等污染的可能性，而且不同批次間的血清差異也會導致產品質量難以控制，同時也加大了下游分離純化的難度。與血清貼壁培養技術相比，無血清全懸浮培養技術無需昂貴的微載體，省去了消化收獲細胞的操作，降低了污染風險和生產成本，縮短了生產時間。由于無血清懸浮培養技術不需要貼附基質，可節約設備空間，提高設備利用率，便于擴大生產規模。但是，因DF-1細胞為成纖維細胞，成纖維細胞為貼壁依賴性生長，很難將其馴化為懸浮細胞。因此，如何馴化獲得懸浮DF-1細胞是本領域技術人員亟待解決的問題。

發明內容

針對現有技術的種種不足，為了解決上述問題，現提出一種細胞全懸浮馴化方法、DF-1細胞全懸浮馴化方法及應用，為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種細胞全懸浮馴化方法，包括如下步驟：將在含血清培養基中貼壁培養的貼壁培養型細胞直接轉到無血清培養基中懸浮培養，培養幾代后再次用含血清培養基進行貼壁培養，如此反復多次培養后即可獲得全懸浮培養型細胞。

一種DF-1細胞全懸浮馴化方法，包括如下步驟：

(1)對貼壁培養型DF-1細胞用含有血清的培養基進行培養至形成致密單層，選用生長正常且邊緣清晰的細胞用于馴化；

(2)將步驟(1)中培養的DF-1細胞用胰酶消化后用無血清培養基懸浮培養若干次后，將懸浮細胞離心棄上清，將離心后獲得的DF-1細胞用含有血清的培養基中重懸至貼壁狀態并培養若干次；

(3)將步驟(2)最終獲得的DF-1細胞重復采用步驟(2)的方法培養多次；

(4)將步驟(3)最終獲得的DF-1細胞用胰酶消化后用無血清培養基懸浮培養，用無血清培養基懸浮培養若干次后獲得的DF-1細胞即為馴化得到的全懸浮培養型DF-1細胞系。

優選的，步驟(1)中選用經無菌、支原體、外源病毒檢定為陰性的貼壁培養型DF-1細胞進行培養，具體的培養方法為：將貼壁培養型DF-1細胞培養至形成致密單層后用含10％胎牛血清的DMEM培養液分瓶傳代培養，在48-72h內細胞形成致密單層，選用生長正常且邊緣清晰的細胞用于馴化。

優選的，DF-1細胞與含10％胎牛血清的DMEM培養液按1：5比例分瓶傳代培養，培養條件為：在37℃，5％CO2的培養箱中培養。

優選的，步驟(2)和步驟(4)中的無血清培養基中添加有用于降低細胞團結率的肝素鈉。

優選的，肝素鈉的添加量為10μg/ml。