[發(fā)明專利]一種細胞全懸浮馴化方法、DF-1細胞全懸浮馴化方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011101175.3
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN112210530A
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王洪林;劉志亮;范娜娜;孫友君;宋桂才;張恒;盧博;王稼林;馬廣斌;鹿洪偉;鄒海濤
• 申請（專利權(quán)）人: 山東信得動物疫苗有限公司;山東諸子生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/02;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 北京同輝知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11357
• 代理人: 于晶晶

1.一種細胞全懸浮馴化方法，其特征在于，包括如下步驟：將在含血清培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)的貼壁培養(yǎng)型細胞直接轉(zhuǎn)到無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)幾代后再次用含血清培養(yǎng)基進行貼壁培養(yǎng)，如此反復(fù)多次培養(yǎng)后即可獲得全懸浮培養(yǎng)型細胞。

2.一種DF-1細胞全懸浮馴化方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)對貼壁培養(yǎng)型DF-1細胞用含有血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)至形成致密單層，選用生長正常且邊緣清晰的細胞用于馴化；

(2)將步驟(1)中培養(yǎng)的DF-1細胞用胰酶消化后用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)若干次后，將懸浮細胞離心棄上清，將離心后獲得的DF-1細胞用含有血清的培養(yǎng)基中重懸至貼壁狀態(tài)并培養(yǎng)若干次；

(3)將步驟(2)最終獲得的DF-1細胞重復(fù)采用步驟(2)的方法培養(yǎng)多次；

(4)將步驟(3)最終獲得的DF-1細胞用胰酶消化后用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)若干次后獲得的DF-1細胞即為馴化得到的全懸浮培養(yǎng)型DF-1細胞系。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DF-1細胞全懸浮馴化方法，其特征在于，步驟(1)中選用經(jīng)無菌、支原體、外源病毒檢定為陰性的貼壁培養(yǎng)型DF-1細胞進行培養(yǎng)，具體的培養(yǎng)方法為：將貼壁培養(yǎng)型DF-1細胞培養(yǎng)至形成致密單層后用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液分瓶傳代培養(yǎng)，在48-72h內(nèi)細胞形成致密單層，選用生長正常且邊緣清晰的細胞用于馴化。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DF-1細胞全懸浮馴化方法，其特征在于，步驟(2)和步驟(4)中的無血清培養(yǎng)基中添加有用于降低細胞團結(jié)率的肝素鈉。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DF-1細胞全懸浮馴化方法，其特征在于，步驟(2)中DF-1細胞用胰酶消化后用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)時，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度，培養(yǎng)48h-72h取樣計細胞密度與細胞活率，根據(jù)細胞密度與細胞活率決定是否需要離心換用新鮮無血清培養(yǎng)基重新懸浮培養(yǎng)，若不需要離心換用新鮮無血清培養(yǎng)基重新懸浮培養(yǎng)，則用新鮮無血清培養(yǎng)基稀釋調(diào)整細胞密度繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)上述培養(yǎng)方式若干次即無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)若干次后，將懸浮細胞離心棄上清，將離心后獲得的DF-1細胞用含胎牛血清的培養(yǎng)基重懸至貼壁狀態(tài)并培養(yǎng)傳代若干次。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的DF-1細胞全懸浮馴化方法，其特征在于，步驟(2)中DF-1細胞用胰酶消化后用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)時，用無血清培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整至5-8×10⁵/ml，培養(yǎng)48h-72h取樣計細胞密度與細胞活率，若細胞密度未達到1.5×10⁶/ml，細胞活率高于80％，則離心后換用新鮮無血清培養(yǎng)基重新懸浮培養(yǎng)，若細胞密度達到1.5×10⁶/ml以上，細胞活率高于80％，則用新鮮無血清培養(yǎng)基稀釋調(diào)整細胞密度為8×10⁵/ml繼續(xù)培養(yǎng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的DF-1細胞全懸浮馴化方法，其特征在于，步驟(4)中DF-1細胞用胰酶消化后用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)時，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度，培養(yǎng)48h-72h取樣計細胞密度與細胞活率，根據(jù)細胞密度與細胞活率決定是否需要離心換用新鮮無血清培養(yǎng)基重新懸浮培養(yǎng)，若不需要離心換用新鮮無血清培養(yǎng)基重新懸浮培養(yǎng)，則用新鮮無血清培養(yǎng)基稀釋調(diào)整細胞密度繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)上述培養(yǎng)方式若干次即用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)若干次后，將獲得的DF-1細胞用無血清培養(yǎng)基重新調(diào)整細胞密度，培養(yǎng)48h-72h取樣計細胞密度與細胞活率，根據(jù)細胞密度與細胞活率決定是否需要離心換用新鮮無血清培養(yǎng)基重新懸浮培養(yǎng)，若不需要離心換用新鮮無血清培養(yǎng)基重新懸浮培養(yǎng)，則用新鮮無血清培養(yǎng)基稀釋調(diào)整細胞密度繼續(xù)培養(yǎng)，若連續(xù)培養(yǎng)多代，每代細胞在48h-72h檢測細胞密度時，均達到設(shè)定數(shù)值以上，則無血清培養(yǎng)基中不再添加肝素鈉，此時馴化得到的細胞即為全懸浮培養(yǎng)型DF-1細胞系。