[發(fā)明專利]一種評價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011100817.8
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN112226491A
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁豐華;張俊杰;萬紹貴;林立安;陳曉明;劉燕
• 申請（專利權(quán)）人: 贛南醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6811
• 分類號: C12Q1/6811
• 代理公司: 重慶市信立達(dá)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

本發(fā)明屬于生物標(biāo)記物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種評價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法，包括：進(jìn)行血清樣品中RNA的提取得到RNA樣本；將RNA樣本反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，標(biāo)記cRNA的合成、純化，并進(jìn)行cRNA片段化；將片段化的cRNA與芯片進(jìn)行雜交，芯片掃描，得到評價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物；對生物標(biāo)志物的診斷價(jià)值進(jìn)行驗(yàn)證。本發(fā)明通過膿毒癥患者血清樣本進(jìn)行檢測和分析，初步篩選得到血清標(biāo)志物，并進(jìn)行血清標(biāo)志物的再次篩選，得到的標(biāo)志物的診斷價(jià)值更高，能夠提高膿毒癥的早期預(yù)警的敏感性和特異性，預(yù)測膿毒癥的病情進(jìn)展，為臨床早期干預(yù)提供參考依據(jù)，最終降低膿毒癥的死亡率，具有良好的可重復(fù)性，適用于膿毒癥診斷標(biāo)志物的檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物標(biāo)記物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種評價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法。

背景技術(shù)

目前，膿毒癥是由于免疫系統(tǒng)對于侵襲性感染的應(yīng)答而成為一種異質(zhì)性綜合征。當(dāng)伴隨器官系統(tǒng)性功能紊亂或心血管性休克，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的膿毒癥或膿毒癥性休克，這是嚴(yán)重病患發(fā)病率和死亡率的主要原因。報(bào)道顯示，膿毒癥是非冠脈ICU病患最主要的死因。膿毒癥是缺乏可靠的診斷標(biāo)準(zhǔn)的異質(zhì)性疾病，由于血培養(yǎng)的陽性率較低，許多病例的診斷依賴于相對主觀的臨床環(huán)境，導(dǎo)致診斷出現(xiàn)變異性，診斷和啟動(dòng)治療仍需要通過評估病史，感染癥狀及進(jìn)展為急性器官衰竭可能性。生物標(biāo)志物能幫助縮短這一過程，有提高膿毒癥診斷和治療的潛在價(jià)值。但是目前評價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選的方法復(fù)雜，并且生物標(biāo)記物的靈敏度低，在臨床中診斷價(jià)值較小。

通過上述分析，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題及缺陷為：目前評價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選的方法復(fù)雜，并且生物標(biāo)記物的靈敏度低，在臨床中診斷價(jià)值較小。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種評價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種評價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法，所述評價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法包括以下步驟：

步驟一，抽取確診為膿毒癥且無其他免疫疾病的患者的靜脈血，將靜脈血置于離心管中；將盛有靜脈血的離心管置于離心機(jī)內(nèi)離心；

步驟二，將離心管置于恒溫水浴箱內(nèi)，設(shè)定水浴溫度為37℃，靜置4～5min；使用玻璃小滴棒將纖維蛋白剝離到離心管的管壁上，同時(shí)將離心管再次置于離心機(jī)中進(jìn)行二次離心；

步驟三，取1ml血清樣本置于離心管中，加入2mlTrizolReagent，振蕩使二者融合，靜置后進(jìn)行劇烈振蕩至離心管內(nèi)無沉淀物；

步驟四，在離心管內(nèi)加入1ml氯仿，振蕩使二者融合，靜置直至出現(xiàn)分層；將分層液體置于離心機(jī)中，設(shè)定離心溫度為4℃、離心轉(zhuǎn)速為6000～8000r/min進(jìn)行10～12min離心，棄除上清液；

步驟五，在離心管中加入3ml乙醇，振蕩后將離心管置于離心機(jī)內(nèi)，設(shè)定離心溫度為4℃，離心轉(zhuǎn)速為8000～10000r/min進(jìn)行3～5min離心，棄除上清液；對離心管內(nèi)的液體進(jìn)行干燥，至離心管內(nèi)無液體殘留；

步驟六，在離心管中加入RNase水，在55～60℃環(huán)境內(nèi)孵育10～15min，進(jìn)行血清樣品中RNA的提取，得到RNA樣本；

步驟七，檢測RNA樣本的RNA純度，將檢測結(jié)果與預(yù)設(shè)純度進(jìn)行對比，并將符合純度要求的樣本置于冰箱中在-80℃環(huán)境下進(jìn)行保存；

步驟八，將步驟七保存的RNA樣本取出，將RNA樣本反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行標(biāo)記cRNA的合成；

步驟九，將步驟八得到的合成的cRNA溶于結(jié)合緩沖液中，并加入蛋白酶抑制劑，以超聲破碎儀震破細(xì)胞，于4℃環(huán)境下離心15～20min，移除細(xì)胞碎片，過濾上清液；

步驟十，將步驟九過濾后的上清液注入已事先通過結(jié)合緩沖液的金屬螯合層析管柱，清洗緩沖液清洗管柱，以沖洗緩沖液沖洗，得到純化物，并進(jìn)行cRNA片段化；