[發(fā)明專利]一種評(píng)價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011100817.8
• 申請(qǐng)日: 2020-10-15
• 公開（公告）號(hào): CN112226491A
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁豐華;張俊杰;萬(wàn)紹貴;林立安;陳曉明;劉燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 贛南醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6811
• 分類號(hào): C12Q1/6811
• 代理公司: 重慶市信立達(dá)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.一種評(píng)價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法，其特征在于，所述評(píng)價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法包括以下步驟：

步驟一，抽取確診為膿毒癥且無(wú)其他免疫疾病的患者的靜脈血，將靜脈血置于離心管中；將盛有靜脈血的離心管置于離心機(jī)內(nèi)離心；

步驟二，將離心管置于恒溫水浴箱內(nèi)，設(shè)定水浴溫度為37℃，靜置4～5min；使用玻璃小滴棒將纖維蛋白剝離到離心管的管壁上，同時(shí)將離心管再次置于離心機(jī)中進(jìn)行二次離心；

步驟三，取1ml血清樣本置于離心管中，加入2ml Trizol Reagent，振蕩使二者融合，靜置后進(jìn)行劇烈振蕩至離心管內(nèi)無(wú)沉淀物；

步驟四，在離心管內(nèi)加入1ml氯仿，振蕩使二者融合，靜置直至出現(xiàn)分層；將分層液體置于離心機(jī)中，設(shè)定離心溫度為4℃、離心轉(zhuǎn)速為6000～8000r/min進(jìn)行10～12min離心，棄除上清液；

步驟五，在離心管中加入3ml乙醇，振蕩后將離心管置于離心機(jī)內(nèi)，設(shè)定離心溫度為4℃，離心轉(zhuǎn)速為8000～10000r/min進(jìn)行3～5min離心，棄除上清液；對(duì)離心管內(nèi)的液體進(jìn)行干燥，至離心管內(nèi)無(wú)液體殘留；

步驟六，在離心管中加入RNase水，在55～60℃環(huán)境內(nèi)孵育10～15min，進(jìn)行血清樣品中RNA的提取，得到RNA樣本；

步驟七，檢測(cè)RNA樣本的RNA純度，將檢測(cè)結(jié)果與預(yù)設(shè)純度進(jìn)行對(duì)比，并將符合純度要求的樣本置于冰箱中在-80℃環(huán)境下進(jìn)行保存；

步驟八，將步驟七保存的RNA樣本取出，將RNA樣本反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行標(biāo)記cRNA的合成；

步驟九，將步驟八得到的合成的cRNA溶于結(jié)合緩沖液中，并加入蛋白酶抑制劑，以超聲破碎儀震破細(xì)胞，于4℃環(huán)境下離心15～20min，移除細(xì)胞碎片，過(guò)濾上清液；

步驟十，將步驟九過(guò)濾后的上清液注入已事先通過(guò)結(jié)合緩沖液的金屬螯合層析管柱，清洗緩沖液清洗管柱，以沖洗緩沖液沖洗，得到純化物，并進(jìn)行cRNA片段化；

步驟十一，將片段化的cRNA與芯片進(jìn)行雜交，洗滌，進(jìn)行芯片掃描，進(jìn)行雜交后IncRNAs的檢測(cè)，并依照預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行符合要求的IncRNAs的初步篩選，得到多個(gè)評(píng)價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物；

步驟十二，對(duì)得到多個(gè)評(píng)價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的診斷價(jià)值進(jìn)行驗(yàn)證，擴(kuò)大樣本評(píng)價(jià)候選標(biāo)志物對(duì)膿毒癥的診斷價(jià)值，并對(duì)診斷價(jià)值進(jìn)行排序；

步驟十三，選擇診斷價(jià)值最高的生物標(biāo)志物作為評(píng)價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物，并對(duì)該生物標(biāo)志物進(jìn)行敏感度和特異度的測(cè)定，完成所述評(píng)價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選。

2.如權(quán)利要求1所述評(píng)價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法，其特征在于，步驟一中，所述將盛有靜脈血的離心管置于離心機(jī)內(nèi)離心的條件為：設(shè)定離心速率為2000～2500r/min，離心時(shí)間為3～5min。

3.如權(quán)利要求1所述評(píng)價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法，其特征在于，步驟二中，所述將離心管再次置于離心機(jī)中進(jìn)行二次離心的條件為：設(shè)置離心速率為3000～3500r/min，離心時(shí)間為2～3min。

4.如權(quán)利要求1所述評(píng)價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法，其特征在于，步驟七中，所述檢測(cè)RNA樣本的RNA純度時(shí)，使用Nano Drop-2000進(jìn)行檢測(cè)。

5.如權(quán)利要求1所述評(píng)價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法，其特征在于，步驟七中，所述預(yù)設(shè)純度為1.26～1.42。

6.如權(quán)利要求1所述評(píng)價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法，其特征在于，步驟八中，所述將RNA樣本反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的方法為：

(1)將RNA樣本在4℃環(huán)境下進(jìn)行解凍；

(2)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；

(3)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方式不間斷地對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。

7.如權(quán)利要求6所述評(píng)價(jià)膿毒癥的生物標(biāo)志物的篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，所述將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的條件為：設(shè)定反轉(zhuǎn)錄所需溫度為50～60℃、反轉(zhuǎn)錄時(shí)間為20～25min。