[發(fā)明專利]一種毒品原植物恰特草及其制品實(shí)時(shí)熒光PCR檢測引物、探針、方法和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011097678.8
• 申請日: 2020-10-14
• 公開（公告）號: CN112195261B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉二龍;左然玲;盧麗;牟桂萍;李志勇;王毅謙;高秀潔;鄭冠津;華展義
• 申請（專利權(quán)）人: 黃埔海關(guān)技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 陳潔娣;劉明星

本發(fā)明公開了一種恰特草及其制品實(shí)時(shí)熒光PCR檢測引物、探針、方法和試劑盒。本發(fā)明針對恰特草葉綠體特異性序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立恰特草特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，具有特異性好、靈敏度高、可重復(fù)性良好等優(yōu)點(diǎn)，最低檢測下限為0.02％。有效的解決恰特草特異性快速檢測技術(shù)的問題，該方法可應(yīng)用于進(jìn)出境口岸檢驗(yàn)檢疫監(jiān)管的恰特草及其產(chǎn)品的檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種毒品原植物恰特草及其制品實(shí)時(shí)熒光PCR檢測引物、探針、方法和試劑盒。

背景技術(shù)

恰特草(Catha134 edulis)，又名：巧茶、也門茶、阿拉伯茶、埃塞俄比亞茶等，屬衛(wèi)矛科(Celastraceae)巧茶屬(Catha134)植物，產(chǎn)于東非和阿拉伯半島等地區(qū)。其含興奮化學(xué)物質(zhì)卡西酮，對人體中樞神經(jīng)具有刺激作用，長期嚼食會染癖成癮，又被稱為“東非罌粟”，具有嚴(yán)重的社會危害性。世界衛(wèi)生組織將恰特草歸類為Ⅱ類軟性毒品。很多國家已將其列為興奮劑或受管制藥物，嚴(yán)禁旅客攜帶或郵寄入境。2014年，恰特草已列入《精神藥品品種目錄(2013版)》，被視為第一類精神藥品，屬毒品范疇，嚴(yán)禁攜帶入境。

恰特草作為一種新型的毒品原植物，外形似茶葉等植物。其經(jīng)烘炒后的枝葉，外形酷似茶葉，形態(tài)上具有很高的偽裝性，一些不法分子在高額利潤的驅(qū)使下鋌而走險(xiǎn)進(jìn)行非法走私與貿(mào)易。國內(nèi)也陸續(xù)有查獲的相關(guān)報(bào)道，如2016年青島海關(guān)查獲新型毒品恰特草，形似鐵觀音；原廣州機(jī)場出入境檢驗(yàn)檢疫局于2012年查獲干燥的“香椿葉”名義進(jìn)口的恰特草一批。

目前口岸執(zhí)法鑒定主要依靠傳統(tǒng)的形態(tài)識別、質(zhì)譜法和DNA條碼法三類方法。

形態(tài)識別方法對于形態(tài)完整或新鮮的恰特草有一定的鑒別意義，但其鑒別需要形態(tài)學(xué)鑒別經(jīng)驗(yàn)積累，技術(shù)推廣較困難，不適合一線監(jiān)管人員快速掌握，特別對于一些形態(tài)特征被破壞，外觀不完整，或是加工混雜的產(chǎn)品，形態(tài)學(xué)的方法就難以適用這類情形，具有一定的局限性。

質(zhì)譜方法主要檢測恰特草中的卡西酮，新鮮的恰特草含有興奮劑卡西酮和去甲麻黃堿，其中卡西酮結(jié)構(gòu)不太穩(wěn)定，采摘后72h內(nèi)就會產(chǎn)生一定的分解，易分解成去甲偽麻黃堿和去甲麻黃堿，由于在干燥的恰特草中無法檢出卡西酮，因此質(zhì)譜方法存在一定的局限。郭海榮等建立了恰特草的質(zhì)譜檢測方法(郭海榮、郭鳴等，恰特草的氣相色譜/質(zhì)譜檢測方法及成分變化[J].河北公安警察職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014,14(2):22-23)，該檢測方法一般采用5.0g恰特草葉進(jìn)行提取，提取過程包括用乙酸乙酯超聲、浸泡過夜等，提取過程較復(fù)雜且時(shí)間較長，難以滿足案件緊急時(shí)對檢測周期的要求；所需樣品用量較多，難以適應(yīng)微量樣品的情況，另外該方法需要質(zhì)譜等大型檢測儀器，價(jià)格昂貴。

DNA條碼方法：申鈺柯等采用DNA條形碼進(jìn)行恰特草的檢測(申鈺柯、劉棟業(yè)等，DNA條形碼在新型毒品原植物恰特草種屬鑒定中的應(yīng)用研究[J].森林公安，2017,3:29-31)。其選擇序列為衛(wèi)茅科的通用保守基因rbcL的共有片段，(KX377451)，檢測的步驟包括：通用引物的PCR擴(kuò)增，電泳檢測，外送測序公司進(jìn)行測序，擬采用進(jìn)化樹方法進(jìn)行比對分析遺傳親源關(guān)系，但目前該類保守基因可供分析比對的序列數(shù)據(jù)量少，該文中也未出示進(jìn)化分析的數(shù)據(jù)。此外該類方法需經(jīng)普通PCR、電泳、測序和進(jìn)化樹分析等過程，檢測步驟繁瑣，周期長，檢測通量低，難以滿足口岸監(jiān)管部門對恰特草快速分類鑒定需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，快速準(zhǔn)確鑒別毒品原植物恰特草及其制品特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測引物、探針、方法和試劑盒。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種恰特草及其制品實(shí)時(shí)熒光PCR檢測引物，所述的檢測引物如下所示：

Catha134-F：5'-AGGTGTGATAAAAATGAGTCCCAGTA-3'(如SEQ ID NO.1所示)

Catha134-R：5'-TTTGGCGAGGGACTGAATAATC-3'(如SEQ ID NO.2所示)。