[發明專利]一種肝細胞培養基、培養方法及其用途

有效

• 申請號: 202011097462.1
• 申請日: 2020-10-14
• 公開（公告）號: CN112094803B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 黃鵬羽;毛一雷;莊緒冉;劉俊來;彭文博
• 申請（專利權）人: 上?？萍即髮W;中國醫學科學院北京協和醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

本發明涉及原代細胞體外培養領域，特別是涉及一種肝細胞培養基、培養方法及其用途。所述肝細胞培養基包括增殖培養基，所述增殖培養基包括以下成分：液體基礎培養基、半乳糖、胰島素?轉鐵蛋白?亞硒酸鈉、脯氨酸、煙酰胺、鳥氨酸、轉化生長因子α、表皮生長因子、地塞米松、Y?27632、A?83?01、CHIR99021。本發明建立了原代肝細胞的長期體外擴增體系；肝細胞傳代擴增培養時完全分化而不發生細胞退分化或轉分化，降低了致癌風險，而且誘導成熟的肝細胞與原代肝細胞的肝功能差異小。

技術領域

本發明涉及原代細胞體外培養領域，特別是涉及一種肝細胞培養基、培養方法及其用途。

背景技術

肝細胞的體外培養對于推進肝臟細胞療法、肝細胞死亡和肝臟再生機制以及肝臟疾病藥物研究等都具有重要的意義。

目前已經報道了幾種可以對肝細胞進行體外培養的方法，如Takeshi Katsuda課題組在2016年報道，可以通過在培養基中添加化學小分子Y-27632、A-83-01和CHIR99021實現大鼠和小鼠肝細胞的體外擴增，培養的細胞退分化為具有雙潛能性的肝祖細胞，經過進一步誘導可以分化為肝細胞或膽管細胞。2018年，中國科學院上海生化細胞研究所惠利健課題組發現并報道，HM培養基可以誘導人肝細胞在體外以雙潛能的形式傳代擴增培養。2019年，北京大學鄧宏魁教授實驗室報道了一種通過添加5種小分子化合物使原代肝實質細胞在體外長期(大于4周)穩定培養的技術，然而該技術只能用于維持培養中的肝細胞的性能，而不能用于肝細胞的體外擴增。前期的這些報道揭示了肝細胞體外擴增培養的挑戰性。目前已建立的肝細胞體外培養系統還不能實現真正的肝細胞體外擴增培養，而只能以先退分化傳代再誘導其分化為目的細胞的形式進行。誘導成熟后的肝細胞雖然具有一定的肝功能，但是與原代肝細胞相比仍具有明顯的差異。同時誘導的肝細胞存在分化不完全的可能性，因而具有潛在的致瘤風險。

基于這樣的技術背景，建立功能性肝細胞長期體外傳代培養的培養體系，實現肝細胞在長期傳代的過程中仍保持其完全分化特征和功能是目前亟待解決的難題。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種肝細胞培養基、培養方法及其用途，用于解決現有技術中的問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供一種肝細胞培養基，所述培養基包括增殖培養基，所述增殖培養基以增殖培養基總量為基礎計，包括以下成分：

液體基礎培養基

優選地，所述肝細胞培養基還包括成熟培養基，所述成熟培養基以成熟培養基的總量為基礎計，包括以下成分：

液體基礎培養基

優選地，所述腺苷酸環化酶激活劑為弗斯可林。

優選地，所述弗斯可林的濃度為0.1μM～100μM，優選為1～50μM

優選地，所述肝細胞培養基中胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉為胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉的混合制劑。

優選地，所述Y-27632為Rho相關蛋白激酶抑制劑。

優選地，所述A-83-01為轉化生長因子-β通路抑制劑。

優選地，所述CHIR99021為Wnt通路活化劑。

優選地，所述半乳糖的濃度為1.0～2.0g/L，更優選為1.6～2g/L；

優選地，所述脯氨酸的濃度為：0.1～1.0g/L，更優選為0.1～0.5g/L；

優選地，所述鳥氨酸的濃度為：0.01～0.3g/L，更優選為0.05～0.15g/L；