[發明專利]6-羥基硫酸褪黑素衍生物及其免疫原、特異性抗體的制備方法和應用

在審

• 申請號: 202011096209.4
• 申請日: 2020-10-14
• 公開（公告）號: CN112225795A
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 張小可;徐琦鋆;何秀麗;陸麗華
• 申請（專利權）人: 湖南蘇陽醫療科技有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/107;C07K16/44;G01N33/53;G01N33/58;G01N33/68;G01N33/543;C07D209/14
• 代理公司: 蘇州知途知識產權代理事務所(普通合伙) 32299
• 代理人: 孫占莉

1.一種6-羥基硫酸褪黑素衍生物，其特征在于，具有如下式I所示的結構：

2.一種結構式如式I所示的6-羥基硫酸褪黑素衍生物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將化合物1與氯甲酸乙酯在堿性條件下反應，得到化合物2：

(2)將化合物2與乙酰氯反應，得到化合物3：

(3)將化合物3與2-(氨基氧基)乙酸叔丁酯在堿性條件下反應，得到化合物4：

其中，所述2-(氨基氧基)乙酸叔丁酯具有如下結構：

(4)將化合物4通過水解反應，得到式I所示的6-羥基硫酸褪黑素衍生物：

優選地，步驟(1)中化合物1與氯甲酸乙酯的摩爾投料比為1:0.5～1.5，更優選地，為1:1～1.2；所述的堿為NaOH、KOH、Na₂CO₃、K₂CO₃或LiOH中的一種，優選所述堿為NaOH；

進一步優選地，步驟(2)反應中加入三氯化鋁作為催化劑，其中化合物2、乙酰氯和三氯化鋁的摩爾用量比為1:1～1.1:1～1.1；

進一步優選地，步驟(3)中化合物3與2-(氨基氧基)乙酸叔丁酯的摩爾用量比為1:0.8～1.2；所述堿為NaOH、KOH、Na₂CO₃、K₂CO₃，或LiOH中的一種，優選所述堿為K₂CO₃；

進一步優選地，步驟(4)中所述水解反應是向反應液中加入酸，進行水解反應，所述酸為HCl與甲醇的混合溶液，其中HCl與MeOH的體積比為1:5～10，HCl的濃度為6mol/L～8mol/L。

3.一種6-羥基硫酸褪黑素免疫原，其特征在于，所述6-羥基硫酸褪黑素免疫原由結構式如式I所示的6-羥基硫酸褪黑素衍生物與載體蛋白連接而成，其結構式如式Ⅱ所示：

其中，所述載體蛋白為重組牛血清白蛋白。

4.根據權利要求3所述的6-羥基硫酸褪黑素免疫原，其特征在于，所述重組牛血清白蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO：1。

5.一種如權利要求3-4任一項所述的6-羥基硫酸褪黑素免疫原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(B1)載體蛋白溶液的制備：將權利要求3-4任一項中所述的重組牛血清白蛋白溶解于磷酸鹽緩沖液中，得到載體蛋白溶液；

(B2)6-羥基硫酸褪黑素衍生物溶液的制備：將式I所示的6-羥基硫酸褪黑素衍生物與二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸鉀緩沖液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺混合，攪拌溶解，得到6-羥基硫酸褪黑素衍生物溶液；

(B3)6-羥基硫酸褪黑素免疫原的合成：將步驟(B2)得到的6-羥基硫酸褪黑素衍生物溶液加入到步驟(B1)得到的載體蛋白溶液中，攪拌反應，經透析純化，得到6-羥基硫酸褪黑素免疫原。

6.一種抗6-羥基硫酸褪黑素特異性抗體，其特征在于，所述抗6-羥基硫酸褪黑素特異性抗體是使用權利要求3-4任一項所述的6-羥基硫酸褪黑素免疫原對實驗動物進行注射后所得到的特異性抗體，所述的實驗動物為兔子、山羊、綿羊、小鼠、大鼠、豚鼠或馬中的一種。

7.一種權利要求6所述的抗6-羥基硫酸褪黑素特異性抗體的制備方法，其特征在于，包含以下步驟：

(C1)將權利要求3-4任一項所述的6-羥基硫酸褪黑素免疫原用磷酸鹽緩沖液稀釋，得到6-羥基硫酸褪黑素人工抗原溶液，然后將6-羥基硫酸褪黑素人工抗原溶液與等量弗氏完全佐劑混合，對實驗動物進行多點注射；

(C2)3-6周后，再用相同的6-羥基硫酸褪黑素人工抗原溶液與等量弗氏不完全佐劑混合，對步驟(C1)所述的實驗動物進行多點注射，之后每隔3-6周注射一次，共計注射3-10次；

(C3)對步驟(C2)中完成注射的實驗動物取血，分離純化，得到抗6-羥基硫酸褪黑素特異性抗體。