[發明專利]一種用于核酸快速檢測的側流層析-重組酶恒溫擴增方法

在審

• 申請號: 202011091352.4
• 申請日: 2020-10-13
• 公開（公告）號: CN112195220A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 陳大為;陳龍;李佳慧;張瑤;孫玉鳳
• 申請（專利權）人: 濟南國益生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6804;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 濟南信在專利代理事務所(特殊普通合伙) 37271
• 代理人: 黃波

本申請屬于試劑盒技術領域，具體為一種用于核酸快速檢測的側流層析?重組酶恒溫擴增方法，步驟如下：(1)提總RNA，通過反轉錄獲得cDNA；(2)設計引物和探針；(3)將cDNA中加入擴增反應試劑進行RMA擴增反應；(4)應用側流層析試紙條進行擴增產物的檢測：陽性樣品，擴增產物由于毛細管作用力從樣品墊側流至結合墊，其上的生物素與結合墊上的鏈霉親和素特異性結合，復合物側流至T線后，擴增產物上的熒光素與T線上的熒光素抗體特異性結合，結合墊上過量的鏈霉親和素又與C線上的生物素特異性結合，結合墊上鏈霉親和素被膠體金標記，T線與C線同時顯色；陰性樣品，結合墊上的鏈霉親和素與C線上的生物素特異性結合，所以只有C線顯色。

技術領域

本申請屬于試劑盒技術領域，具體為一種用于核酸快速檢測的側流層析-重組酶恒溫擴增方法。

背景技術

目前針對RNA病毒的較成熟的核酸檢測技術主要有：實時熒光定量PCR、環介導等溫擴增(LAMP)、依賴核酸序列擴增(NASBA)、重組酶聚合酶擴增技術(RMA)和基因芯片等。實時熒光定量PCR由于檢測靈敏度高，適用范圍廣，操作簡便等原因應用廣泛，但其操作程序復雜、需要精密的儀器、檢測時間較長，不利于非實驗室環境下現場檢測以及基層實驗室的推廣應用。基因芯片可以一次分析大量樣品，但容易出現假陽性，重復性差，且技術成本昂貴、復雜。核酸恒溫擴增技術由于其具備敏感、特異、快速、簡便，不需要昂貴儀器設備等特點，已經在多個領域開展應用。但LAMP需要4-6條引物，設計復雜；NASBA方法容易出現假陰性或假陽性結果。另外，LAMP和NASBA反應時間至少需要60min。

重組酶介導擴增(RMA)技術是一種核酸等溫擴增技術，主要依賴重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶三種酶。其原理是重組酶與引物結合形成復合體，并在雙鏈DNA中識別同源序列；然后重組酶解開雙鏈，引物與同源序列發生鏈交換反應并啟動DNA合成，對模板進行指數式擴增；被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。RMA反應最適溫度在37～42℃，整個過程在10-30min內即可完成，30min內就可以將靶序列擴增到10～12數量級，可實現核酸的快速檢測。

RMA技術可以與側向流動免疫層析技術(LFD)相結合進行擴增產物的檢測。在RMA擴增體系中，需要生物素標記的反向引物和熒光基團標記的探針，在距熒光基團30個堿基處有一個脫堿基位點(dSpacer)，該位點可被核酸內切酶IV(nfo酶)識別、切割，產生新的羥基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成帶有生物素和熒光基團雙標記的RMA產物，通過層析膜擴散，被生物素配體和熒光基團標記抗體捕獲，形成具有顏色的檢測線。

本發明采用LFD-RMA技術建立快速檢測核酸的方法，為核酸的現場檢測提供一種快速、簡便、靈敏的新方法。

發明內容

為了解決現有技術的問題，本申請提供了一種用于核酸快速檢測的側流層析-重組酶恒溫擴增方法，本申請是通過下述方案實現的：

一種用于核酸快速檢測的側流層析-重組酶恒溫擴增方法，步驟如下：(1)提取待檢測樣本的總RNA，通過反轉錄獲得cDNA；(2)設計用于核酸檢測的引物和探針；(3)將反轉錄得到的cDNA中加入擴增反應試劑進行RMA擴增反應，擴增條件為：37-42℃水浴5min后，混勻，再37-42℃水浴15min；(4)應用側流層析試紙條進行擴增產物的檢測：對于陽性樣品，擴增產物由于毛細管作用力從樣品墊側流至結合墊，其上的生物素與結合墊上的鏈霉親和素特異性結合，復合物又側流至T線后，擴增產物上的熒光素與T線上的熒光素抗體特異性結合，結合墊上過量的鏈霉親和素又與C線上的生物素特異性結合，又因結合墊上鏈霉親和素被膠體金標記，所以T線與C線同時顯色；對于陰性樣品，結合墊上的鏈霉親和素與C線上的生物素特異性結合，所以只有C線顯色。