[發明專利]一種用于核酸快速檢測的側流層析-重組酶恒溫擴增方法

在審

• 申請號: 202011091352.4
• 申請日: 2020-10-13
• 公開（公告）號: CN112195220A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 陳大為;陳龍;李佳慧;張瑤;孫玉鳳
• 申請（專利權）人: 濟南國益生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6804;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 濟南信在專利代理事務所(特殊普通合伙) 37271
• 代理人: 黃波

1.一種用于核酸快速檢測的側流層析-重組酶恒溫擴增方法，其特征在于，步驟如下：(1)提取待檢測樣本的總RNA，通過反轉錄獲得cDNA；(2)設計用于核酸檢測的引物和探針；(3)將反轉錄得到的cDNA中加入擴增反應試劑進行RMA擴增反應，擴增條件為：37-42℃水浴5min后，混勻，再37-42℃水浴15min；(4)應用側流層析試紙條進行擴增產物的檢測：對于陽性樣品，擴增產物由于毛細管作用力從樣品墊側流至結合墊，其上的生物素與結合墊上的鏈霉親和素特異性結合，復合物又側流至T線后，擴增產物上的熒光素與T線上的熒光素抗體特異性結合，結合墊上過量的鏈霉親和素又與C線上的生物素特異性結合，又因結合墊上鏈霉親和素被膠體金標記，所以T線與C線同時顯色；對于陰性樣品，結合墊上的鏈霉親和素與C線上的生物素特異性結合，所以只有C線顯色。

2.如權利要求1所述的一種用于核酸快速檢測的側流層析-重組酶恒溫擴增方法，其特征在于，所述步驟(2)中所述核酸的引物長度一般為30-35bp，GC含量占40-60％，5’端的3-5個核苷酸不可多于兩個G，3’端應有G和C且連續的三個核苷酸不可相同；核酸探針長度為46-52個核苷酸，探針5’端標記FAM基團，中間THF(dSpacer)替代G或C，dSpacer修飾距5’端28-32個堿基，距3’端13-17個堿基，3’端用C3-spacer修飾抑制DNA鏈的延伸。

3.如權利要求1所述的一種用于核酸快速檢測的側流層析-重組酶恒溫擴增方法，其特征在于，所述水浴的溫度為38℃。

4.如權利要求1所述的一種用于核酸快速檢測的側流層析-重組酶恒溫擴增方法，其特征在于，所述步驟(4)中所述的側向流層析試紙條包括支撐板、樣品墊、結合墊、層析膜和吸水墊。

5.如權利要求4所述的一種用于核酸快速檢測的側流層析-重組酶恒溫擴增方法，其特征在于，所述層析膜為硝酸纖維素膜；所述結合墊上含有鏈霉親和素和膠體金復合物，C線上噴涂生物素，T線上噴涂熒光素抗體。