[發(fā)明專利]高產(chǎn)鳥苷的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011086294.6
• 申請(qǐng)日: 2020-10-12
• 公開（公告）號(hào): CN112574934B
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薛婷莉;胡丹;李鑫磊;吳濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/52;C12N15/53;C12P19/40;C12R1/125;C12R1/07
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發(fā)明提供高產(chǎn)鳥苷的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明還提供發(fā)酵生產(chǎn)嘌呤核苷的方法，包括：1)改造細(xì)菌染色體上編碼NCBI參考序列WP_038462632.1或WP_014469845.1的GMP合成酶基因，使其編碼的GMP合成酶的第234位纈氨酸被其他氨基酸取代，導(dǎo)致該酶活性增強(qiáng)；和/或2)改造細(xì)菌染色體上編碼NCBI參考序列WP_013353436.1的GMP還原酶基因，使其編碼的GMP還原酶的第8位谷氨酸突變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致該酶活性減弱或失活；以及3)用步驟1)和/或步驟2)改造得到的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)嘌呤核苷；所述細(xì)菌是具有嘌呤核苷生產(chǎn)能力的微生物。包含上述兩種突變的微生物可用于發(fā)酵生產(chǎn)鳥苷并提高鳥苷發(fā)酵產(chǎn)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域和生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及高產(chǎn)鳥苷的工程 菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

核苷是一類糖苷的總稱。核苷是核酸和核苷酸的組成成分。核苷是由D-核糖或 D-Z-脫氧核糖與嘧啶堿或嘌呤堿縮合而成。核苷一般為無色結(jié)晶，不溶于普通有機(jī) 溶劑，易溶于熱水，熔點(diǎn)為160～240℃。由D-核糖生成的核苷稱核糖核苷，參與RNA 組成，由D-α-脫氧核糖生成的核苷稱脫氧核糖核苷，參與DNA組成。D-核糖與腺嘌 呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶縮合生成相應(yīng)的腺嘌呤核糖核苷、鳥嘌呤 核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它們分別簡稱 為腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿苷(U)。

鳥嘌呤核苷，又名9-β-D呋喃核糖鳥嘌呤，以下也稱鳥苷，具有多種用途，在食 品和醫(yī)藥行業(yè)有著廣泛的作用。在食品領(lǐng)域，鳥苷是鳥苷酸二鈉的重要前體，而鳥 苷酸二鈉與肌苷酸二鈉組合使用作為食品增鮮劑，廣泛應(yīng)用于雞精、醬油等調(diào)味品 中。在醫(yī)藥領(lǐng)域，鳥苷可以作為多種抗病毒藥物的醫(yī)藥中間體，如無環(huán)鳥苷、三氮 唑核苷、三磷酸鳥苷鈉等都需要鳥苷作為合成原料。

目前，微生物發(fā)酵是生產(chǎn)鳥苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌或短小芽孢桿菌等。在生長菌株的選育與改造過程中，通過使 用紫外誘變、硫酸二乙酯誘變育種，定向選育鳥苷高產(chǎn)菌株；或者根據(jù)細(xì)菌中核苷 酸的代謝路徑和調(diào)節(jié)機(jī)理，深入了解菌株遺傳背景及菌株特性，通過代謝工程手段， 有目的性地對(duì)菌株進(jìn)行改造，以獲得性狀優(yōu)良、能夠高產(chǎn)鳥苷的生產(chǎn)菌株。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)嘌呤核苷的方法或提高嘌呤核苷發(fā)酵產(chǎn)量的方法。

本發(fā)明的另一目的是提供高產(chǎn)鳥苷的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，第一方面，本發(fā)明提供一種發(fā)酵生產(chǎn)嘌呤核苷的方法或 提高嘌呤核苷發(fā)酵產(chǎn)量的方法，包括以下步驟：

(1)改造細(xì)菌染色體上編碼NCBI參考序列WP_038462632.1或WP_014469845.1 的GMP合成酶基因，使其編碼的GMP合成酶的第234位纈氨酸被其他氨基酸(如異亮 氨酸)取代，導(dǎo)致該酶活性增強(qiáng)；和/或

(2)改造細(xì)菌染色體上編碼NCBI參考序列WP_013353436.1的GMP還原酶基因， 使其編碼的GMP還原酶的第8位谷氨酸突變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致該酶活性減弱或失 活；以及

(3)用步驟(1)和/或步驟(2)改造得到的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)嘌呤核苷；

其中，所述細(xì)菌是具有嘌呤核苷生產(chǎn)能力的微生物。

優(yōu)選地，所述細(xì)菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

本發(fā)明中，所述嘌呤核苷優(yōu)選為鳥苷。

第二方面，本發(fā)明提供一種高產(chǎn)鳥苷的工程菌，所述工程菌是通過增強(qiáng)原始菌 株中編碼NCBI參考序列WP_038462632.1或WP_014469845.1的基因，獲得的基因增強(qiáng) 菌株；和/或