[發(fā)明專利]一種草魚出血病二價核酸菌蛻疫苗的制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011085427.8 | 申請日： | 2020-10-12 |
| 公開（公告）號： | CN112206317B | 公開（公告）日： | 2023-09-22 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 郝貴杰;林鋒;沈錦玉;盛鵬程;潘曉藝;袁雪梅;姚嘉赟;徐洋;陳智慧;黃小紅 | 申請（專利權(quán)）人： | 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 |
| 主分類號： | A61K39/15 | 分類號： | A61K39/15;A61P31/14;A61P7/04;C12N15/70;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京慕達星云知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 王敏 |
| 地址： | 313001 浙江*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 草魚 出血病 二價 核酸 疫苗 制備 方法 | ||
本發(fā)明公開了一種草魚出血病二價核酸菌蛻疫苗的制備方法，屬于基因工程疫苗技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開的一種草魚出血病二價核酸菌蛻疫苗的制備方法，首先以GCRV?I、II?S10基因為靶基因，構(gòu)建融合表達GCRV?I、II衣殼蛋白的真核表達載體，并進行體外表達鑒定；第二階段制備大腸桿菌DH5α菌蛻，將裂解質(zhì)粒pHH43導入大腸桿菌DH5α，制備出具有完好外膜的大腸桿菌菌蛻；第三階段進行大腸桿菌菌蛻裝載重組質(zhì)粒研制二價核酸菌蛻疫苗，并進行實驗室免疫效果評價研究，初步確定了免疫方案并進行了免疫示范應(yīng)用。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及基因工程疫苗技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種草魚出血病二價核酸菌蛻疫苗的制備方法。
背景技術(shù)
草魚出血病一直是我國草魚養(yǎng)殖中最難控制的疾病，目前對于病毒病還沒有特效的治療方法，一直采用疫苗免疫作為控制該病的主要方法，最早全國各地相繼應(yīng)用組織漿滅活疫苗進行免疫防治，取得了一定的成效，但組織漿滅活疫苗需大量魚體擴增病毒，費時費力，并存在擴散病毒的危險。后又研制成功細胞滅活疫苗及細胞培養(yǎng)弱毒疫苗并取得了疫苗生產(chǎn)批準文號，在多個地區(qū)進行了推廣應(yīng)用，對草魚出血病的控制起了很大的作用，但細胞滅活疫苗的制備需大量培養(yǎng)病毒并傳代擴增，成本很高，也存在滅活不完全會散毒的危險。弱毒活疫苗常能有效的刺激機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，其主要缺點是接種機體后毒力可能出現(xiàn)返強，以及運輸保存時要求的條件較高。鑒于這些常規(guī)疫苗難以解決的問題以及GCRV出現(xiàn)新的毒力較強的變異毒株即GCRV-II在全國范圍內(nèi)流行的情況，迫切需要研制一種安全、高效且多價的疫苗用于預防草魚出血病的爆發(fā)。
核酸疫苗(nucleic?acid?vaccine)以其無致病性、研制簡單等諸多優(yōu)點成為現(xiàn)代疫苗的研究熱點，該疫苗也稱基因疫苗(genetic?vaccine)或DNA疫苗(DNA?vaccine)，是指將含有編碼某種抗原蛋白的外源基因克隆到真核表達質(zhì)粒載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動物體內(nèi)，并通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達到預防和治療疾病的目的。該疫苗具有安全、價廉、易于制備、改造等優(yōu)點，故一經(jīng)問世便迅速發(fā)展起來，本實驗室也研制了GCRV-I?VP7的核酸疫苗，取得了一定的草魚免疫效果。但越來越多的研究也發(fā)現(xiàn)核酸疫苗存在著免疫方式有限、免疫原性不強，常需高劑量多次免疫等問題。因而，人們開始轉(zhuǎn)向?qū)怂嵋呙缱魟┖洼d體的研究，希望能夠通過各種佐劑、載體的使用來揚長補短，使其免疫效果得到進一步提高。
菌蛻的問世，為核酸的輸送帶來了新的希望，菌蛻是利用基因滅活的方法而產(chǎn)生的細菌空殼，即噬菌體PhiX174裂解蛋白E介導的G-菌的裂解而產(chǎn)生，由于G-菌具有完整的生物親和性的外膜結(jié)構(gòu)，如菌毛能夠進行特異的細胞和組織定位，其表面的脂多糖成分可以作為一種天然佐劑，而且菌蛻的胞周間隙和細胞空腔可接收大量外源物質(zhì)，因而菌蛻成為一種新型無病原性的生物載體和靶向工具，并且有望在增強核酸疫苗免疫原性、彌補其接種方式受限方面開辟一個新的途徑，為更高效的DNA疫苗的開發(fā)提供一個具有廣闊前景的技術(shù)平臺。
因此，提供一種草魚出血病二價核酸菌蛻疫苗的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供了一種草魚出血病二價核酸菌蛻疫苗的制備方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種草魚出血病二價核酸菌蛻疫苗的制備方法，具體步驟如下：
(1)構(gòu)建GCRV-I-II-S10重組質(zhì)粒；
(2)制備大腸桿菌DH5α菌蛻；
(3)制備GCRV二價核酸菌蛻疫苗：
將步驟(2)制備的大腸桿菌DH5α菌蛻重懸于含GCRV-I-II-S10重組質(zhì)粒的PBS體系中，加入CaCl2溶液，搖床孵育，離心，收集沉淀，得到GCRV二價核酸菌蛻疫苗。
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