[發(fā)明專(zhuān)利]一種草魚(yú)出血病二價(jià)核酸菌蛻疫苗的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011085427.8
• 申請(qǐng)日: 2020-10-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112206317B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郝貴杰;林鋒;沈錦玉;盛鵬程;潘曉藝;袁雪梅;姚嘉赟;徐洋;陳智慧;黃小紅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江省淡水水產(chǎn)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): A61K39/15
• 分類(lèi)號(hào): A61K39/15;A61P31/14;A61P7/04;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 王敏

1.一種草魚(yú)出血病二價(jià)核酸菌蛻疫苗的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)構(gòu)建GCRV-I-II-S10重組質(zhì)粒；

(2)制備大腸桿菌DH5α菌蛻；

(3)制備GCRV二價(jià)核酸菌蛻疫苗：

將步驟(2)制備的大腸桿菌DH5α菌蛻重懸于含GCRV-I-II-S10重組質(zhì)粒的PBS體系中，加入CaCl₂溶液，搖床孵育，離心，收集沉淀，得到GCRV二價(jià)核酸菌蛻疫苗；

步驟(1)構(gòu)建GCRV-I-II-S10重組質(zhì)粒的具體步驟如下：

①分別根據(jù)GCRV-I及GCRV-II第10基因片段序列，直接合成可融合表達(dá)的基因序列，并引入HindIII/EcoRI雙酶切位點(diǎn)后的全長(zhǎng)基因序列如SEQ?ID?NO.1所示；

②利用HindIII和EcoRI對(duì)pcDNA3.1(+)載體進(jìn)行雙酶切，再將酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒回收純化；

③將步驟①獲得的基因序列和步驟②酶切純化后的pcDNA3.1(+)載體利用T4DNA連接酶16℃過(guò)夜連接；

④將步驟③獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有50μg·mL^-1Amp⁺的LB平板上進(jìn)行篩選，挑取白色菌落進(jìn)行擴(kuò)增，并小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得pcDNA-I-II-S10重組質(zhì)粒；

步驟(2)制備大腸桿菌DH5α菌蛻的具體步驟如下：

①將裂解質(zhì)粒pHH43轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有30mg/L氯霉素的固體LB平板進(jìn)行篩選，挑取單個(gè)菌落小提質(zhì)粒進(jìn)行EcoRV和KpnI雙酶切鑒定；

②經(jīng)鑒定，將含有裂解質(zhì)粒pHH43的大腸桿菌于28℃200rpm搖床培養(yǎng)，當(dāng)OD₆₀₀＝0.4-0.6時(shí)，迅速升高溫度至42℃以啟動(dòng)E裂解蛋白的表達(dá)，前期每隔20min、后期1h測(cè)定OD值，280min后挑選OD值最小的克隆菌進(jìn)行菌蛻收集；

步驟(3)制備GCRV二價(jià)核酸菌蛻疫苗的具體步驟如下：

將0.5mL濃度為4.6×10⁸CFU/mL菌蛻重懸于含762μgGCRV-I-II-S10重組質(zhì)粒的4.5mL的PBS體系中，加入終濃度25mMCaCl₂溶液，25℃、150rpm搖床孵育15min，8000rpm離心10min收集沉淀，再用PBS將沉淀懸浮稀釋至使用濃度，得到GCRV二價(jià)核酸菌蛻疫苗。