[發明專利]一種草魚出血病二價核酸菌蛻疫苗的制備方法

有效

• 申請號: 202011085427.8
• 申請日: 2020-10-12
• 公開（公告）號: CN112206317B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發明（設計）人: 郝貴杰;林鋒;沈錦玉;盛鵬程;潘曉藝;袁雪梅;姚嘉赟;徐洋;陳智慧;黃小紅
• 申請（專利權）人: 浙江省淡水水產研究所
• 主分類號: A61K39/15
• 分類號: A61K39/15;A61P31/14;A61P7/04;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 王敏

1.一種草魚出血病二價核酸菌蛻疫苗的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)構建GCRV-I-II-S10重組質粒；

(2)制備大腸桿菌DH5α菌蛻；

(3)制備GCRV二價核酸菌蛻疫苗：

將步驟(2)制備的大腸桿菌DH5α菌蛻重懸于含GCRV-I-II-S10重組質粒的PBS體系中，加入CaCl₂溶液，搖床孵育，離心，收集沉淀，得到GCRV二價核酸菌蛻疫苗；

步驟(1)構建GCRV-I-II-S10重組質粒的具體步驟如下：

①分別根據GCRV-I及GCRV-II第10基因片段序列，直接合成可融合表達的基因序列，并引入HindIII/EcoRI雙酶切位點后的全長基因序列如SEQ?ID?NO.1所示；

②利用HindIII和EcoRI對pcDNA3.1(+)載體進行雙酶切，再將酶切產物用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒回收純化；

③將步驟①獲得的基因序列和步驟②酶切純化后的pcDNA3.1(+)載體利用T4DNA連接酶16℃過夜連接；

④將步驟③獲得的連接產物轉化DH5α感受態細胞，在含有50μg·mL^-1Amp⁺的LB平板上進行篩選，挑取白色菌落進行擴增，并小量提取質粒，進行雙酶切鑒定，獲得pcDNA-I-II-S10重組質粒；

步驟(2)制備大腸桿菌DH5α菌蛻的具體步驟如下：

①將裂解質粒pHH43轉化至DH5α感受態細胞，涂布于含有30mg/L氯霉素的固體LB平板進行篩選，挑取單個菌落小提質粒進行EcoRV和KpnI雙酶切鑒定；

②經鑒定，將含有裂解質粒pHH43的大腸桿菌于28℃200rpm搖床培養，當OD₆₀₀＝0.4-0.6時，迅速升高溫度至42℃以啟動E裂解蛋白的表達，前期每隔20min、后期1h測定OD值，280min后挑選OD值最小的克隆菌進行菌蛻收集；

步驟(3)制備GCRV二價核酸菌蛻疫苗的具體步驟如下：

將0.5mL濃度為4.6×10⁸CFU/mL菌蛻重懸于含762μgGCRV-I-II-S10重組質粒的4.5mL的PBS體系中，加入終濃度25mMCaCl₂溶液，25℃、150rpm搖床孵育15min，8000rpm離心10min收集沉淀，再用PBS將沉淀懸浮稀釋至使用濃度，得到GCRV二價核酸菌蛻疫苗。