[發明專利]構建于大腸桿菌中的糞腸球菌群體感應基因開關系統及其表達載體、工程菌和應用

有效

• 申請號: 202011082793.8
• 申請日: 2020-10-10
• 公開（公告）號: CN112391396B
• 公開（公告）日: 2023-09-08
• 發明（設計）人: 吳俊俊;周朋;包美嬌;董明盛
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N15/65;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

本發明公開了一種構建于大腸桿菌中的糞腸球菌群體感應基因開關系統及其表達載體、工程菌和應用，該系統包括糞腸球菌的七肽信息素cCF10基因ccfa，負調控信息素肽基因prgx和啟動子序列Pprgq。本發明基因開關系統是一種不依賴誘導劑，可以自發動態調節靶基因表達的基因開關系統，并利用該系統構建可以在OD₆₀₀到1的狀態下啟動靶基因表達的發酵工程菌，本發明的啟動強度與目前常用的費氏弧菌群體感應系統相比高出10倍。本發明將基因元件分別構建到不同的表達載體上，在工程菌內部構建了一個基因開關系統，具有自發動態調節發酵菌株代謝流，控制基因表達的功能，可以避免誘導劑的添加，節約發酵成本，簡化發酵流程。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種構建于大腸桿菌中的糞腸球菌(Enterococcus?faecalis)群體感應基因開關系統及其表達載體、工程菌和應用。

背景技術

發酵工程菌需要合成大量重組蛋白，搭建合成通路，如果在培養起點就開始大量表達重組蛋白會和細胞代謝競爭胞內資源，給菌體帶來巨大的負擔，代謝網絡失衡會導致一些有毒的中間產物的積累，也會對菌體生長造成毒害，使菌株無法保持良好的生長狀態，影響最終產物的產量。因此前人探索了多種操縱元件，實現對基因的誘導調控，包括：色氨酸操縱子、阿拉伯糖操縱子以及許多雜合操縱子等，其中以受IPTG誘導的乳糖操縱子應用最為廣泛。誘導型啟動子有許多優點，包括能通過調節誘導劑濃度調節基因表達強度、通過控制誘導劑添加時間控制基因表達的啟動時間以平衡菌體的生長和產物的合成等。但是誘導型啟動子也存在許多問題，包括無法實現靶基因的動態調控、對細胞狀態無法及時反饋等。另外，誘導劑昂貴的價格阻礙了其在大規模工業化生產中的應用。

解決這一問題的方法之一就是在發酵菌株內引入動態的基因開關來控制途徑基因的表達，目前已經有許多這方面的嘗試。但是這些策略需要響應于特定的中間產物、細胞狀態或者培養基組成，缺乏普適性，無法應對復雜多變的產物需求。而群體感應(Quorumsensing)系統作為細胞密度的監控感應系統同時具有動態調節和通用性的優點。因此，基于群體感應的動態調節系統具有很高的研究價值以及應用前景。

糞腸球菌(Enterococcus?faecalis)是一種常見的病原菌，使人患尿路感染、腹膜炎和心內膜炎等疾病，也可引起動物疾病，包括公豬睪丸炎、羊羔腦炎和雛鵝敗血癥等，糞腸球菌屬于革蘭氏陽性，通過氨基酸和短肽類物質(AIPs)介導的群體感應系統調控其生命活動過程。近年來，針對分泌到胞外的特異性信號肽分子的生成，信號肽分子的蓄積過程，信號肽分子的最大濃度等方面實施有效地干擾抑制成為研究熱點，但是利用糞腸球菌群體感應系統可以檢測細胞濃度的特性在常見工程菌如大腸桿菌中構建基因開關的應用尚未見報道。

發明內容

發明目的：針對現有技術存在的問題，本發明提供一種構建于大腸桿菌中的糞腸球菌(Enterococcus?faecalis)群體感應基因開關系統，該基因開關系統是一種不依賴誘導劑，可以自發動態調節靶基因表達的基因開關系統，并利用該系統構建可以在合適的OD₆₀₀狀態下啟動靶基因表達的大腸桿菌。

本發明還提供了所述糞腸球菌群體感應基因開關系統的表達載體、工程菌及其應用。

本發明通過將基因元件分別構建到不同的表達載體上，本發明在工程菌(以大腸桿菌為宿主)內部構建了一個基因開關，具有自發動態調節發酵菌株代謝流，控制基因表達的功能，可以避免誘導劑的添加，節約發酵成本，簡化發酵流程。

技術方案：本發明所述一種構建于大腸桿菌中的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)群體感應基因開關系統，該系統元件包括糞腸球菌的七肽信息素cCF10基因ccfa，負調控信息素肽基因prgx和可以感應負調控信息素肽的啟動子序列Pprgq。