[發(fā)明專利]一組焦亡執(zhí)行者融合蛋白和基于熒光素酶片段互補(bǔ)分析技術(shù)的焦亡活性檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011082184.2
• 申請(qǐng)日: 2020-10-12
• 公開（公告）號(hào): CN112210017B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳君;張萍;張效威
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)藥科大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/85;C12Q1/02
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 薛紅凡

本發(fā)明提供了一組焦亡執(zhí)行者融合蛋白和基于熒光素酶片段互補(bǔ)分析技術(shù)的焦亡活性檢測(cè)方法，屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。焦亡執(zhí)行者融合蛋白，包括hGlucN?GSDME融合蛋白和hGlucC?GSDME融合蛋白。一組焦亡活性報(bào)告質(zhì)粒，包括分別含上述兩融合蛋白的編碼序列的真核表達(dá)載體。所述融合蛋白或所述報(bào)告質(zhì)粒在GSDME介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡活性檢測(cè)、制備檢測(cè)GSDME介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡活性的試劑或試劑盒或GSDME介導(dǎo)焦亡誘導(dǎo)劑或抑制劑篩選中的應(yīng)用。本發(fā)明首次將熒光素酶片段互補(bǔ)分析技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞焦亡活性檢測(cè)中，對(duì)GSDME激活水解產(chǎn)物N?GSDME的聚集進(jìn)行檢測(cè)，為研究細(xì)胞焦亡提供了新的技術(shù)方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組焦亡執(zhí)行者融合蛋白和基于熒光素酶片段互補(bǔ)分析技術(shù)的焦亡活性檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

在細(xì)胞正常的生理代謝條件下，蛋白質(zhì)是細(xì)胞活性和各種功能的執(zhí)行者。通過(guò)一系列的相互作用，蛋白質(zhì)參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、分化、凋亡等各個(gè)生命過(guò)程。很多的蛋白質(zhì)在行使功能時(shí)，往往需要首先形成聚合物或則與其它蛋白質(zhì)們形成復(fù)合體。研究蛋白質(zhì)的相互作用是明確蛋白質(zhì)功能和作用機(jī)制的最為重要的環(huán)節(jié)之一。蛋白間的相互作用一般都具有一定的特異性，同時(shí)伴隨蛋白質(zhì)間的相互靠近和各種力(氫鍵和范德華力等)的作用。基于上述特點(diǎn)，目前已經(jīng)發(fā)展了多種用于蛋白質(zhì)間相互作用研究的方法。

體外水平的研究方法主要有免疫共沉淀(Co-IP)、GST融合蛋白pull-down技術(shù)、蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)(proteinmicroarray)等。體內(nèi)(細(xì)胞、動(dòng)物)水平的研究方法則主要包括酵母雙雜交技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)和蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析(Protein fragment complementation assay,PCA)技術(shù)。與其它研究方法相比，PCA技術(shù)具有可定量化和高通量的特點(diǎn)，主要用于相互作用的蛋白質(zhì)文庫(kù)的構(gòu)建、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、生物信號(hào)通路圖的繪制、配體-受體相互作用研究以及對(duì)藥物進(jìn)行高通量篩選等。PCA是指將某個(gè)功能(報(bào)告)蛋白切成兩段(如N端和C端)，分別與另外兩種目標(biāo)蛋白相連形成兩個(gè)融合蛋白；在一個(gè)反應(yīng)體系中，兩個(gè)目標(biāo)蛋白的相互作用使得兩個(gè)功能蛋白質(zhì)片段相互靠近，互補(bǔ)并重建功能蛋白質(zhì)的活性；通過(guò)檢測(cè)功能蛋白質(zhì)的活性來(lái)判斷目標(biāo)蛋白質(zhì)間的相互作用。根據(jù)功能蛋白的兩個(gè)片段互補(bǔ)融合成的報(bào)告蛋白的種類，目前常用的PCA體系可以分為以下幾種：基于DHFR的PCA、基于β-lactamase的PCA、基于熒光蛋白的PCA又稱為雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(Bi-molecular fluorescencecomplementation,BiFC)和基于熒光素酶的PCA。其中基于熒光素酶的PCA相比其它PCA具有高信噪比、可逆性、接近實(shí)時(shí)性的優(yōu)點(diǎn)。

細(xì)胞焦亡(Pyroptosis)又稱細(xì)胞炎性壞死，是一種程序性細(xì)胞死亡，其表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放進(jìn)而激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)，質(zhì)膜會(huì)出現(xiàn)破裂形成直徑1～2nm的小孔，細(xì)胞滲透性腫脹，形成特征性囊泡，胞內(nèi)物質(zhì)(如炎性因子、乳酸脫氫酶)流出。據(jù)報(bào)道焦亡發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制多與Gasdermin家族蛋白的激活有關(guān)：靜息條件下，Gasdermin家族的多種成員包括GSDMD、GSDME、GSDMA、GSDMA3等的C端通過(guò)與N端結(jié)合而抑制其活性功能。在焦亡發(fā)生過(guò)程中，Gasdermin家族成員激活后會(huì)形成C端和N端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，活化后形成的N端結(jié)構(gòu)域可形成寡聚物，進(jìn)而引起一系列焦亡反應(yīng)，如焦亡執(zhí)行者Gasdermin E(GSDME)活化形成N端結(jié)構(gòu)域(N-GSDME)和C端結(jié)構(gòu)域(C-GSDME)。

目前常用的焦亡活性檢測(cè)方法是Western Blot法，該方法檢測(cè)細(xì)胞GSDME和N-GSDME蛋白水平變化，針對(duì)GSDME的水解激活進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)N-GSDME的聚集不能進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)該檢測(cè)方法存在檢測(cè)通量低、檢測(cè)周期長(zhǎng)的問(wèn)題。若能檢測(cè)N-GSDME間的相互作用，即可判斷焦亡過(guò)程的發(fā)生，進(jìn)而可用于焦亡誘導(dǎo)劑和抑制劑的篩選。目前還沒(méi)有在細(xì)胞水平檢測(cè)N-GSDME間聚集的報(bào)告基因技術(shù)方法報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容