[發(fā)明專利]神經(jīng)母細(xì)胞瘤原位模型的建立方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011082107.7
• 申請(qǐng)日: 2020-10-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112980793A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫倩;劉建軍;任曉虎;聶露琳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市疾病預(yù)防控制中心（深圳市衛(wèi)生檢驗(yàn)中心;深圳市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所）
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;C12N5/079;A01K67/027
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務(wù)所有限公司 44228
• 代理人: 鄭學(xué)偉;葉利軍

1.一種神經(jīng)母細(xì)胞瘤原位模型的建立方法，其特征在于，包括：

S10、按1:1比例將MEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基混合制成培養(yǎng)基混合液，將神經(jīng)母細(xì)胞瘤接種于所述培養(yǎng)基混合液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；

S20、將培養(yǎng)后的神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)行稀釋，制成細(xì)胞懸液；

S30、取用所述細(xì)胞懸液注入C57BL/6小鼠的顱骨周邊，并將所述C57BL/6小鼠進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的體積k處于2.2cm³至3.5cm³之間時(shí)，確定得到神經(jīng)母細(xì)胞瘤原位模型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)母細(xì)胞瘤原位模型的建立方法，其特征在于，所述S10中，具體包括：

S11、采用青霉素100-200ug/ml、鏈霉素100-200ug/ml、10-15ng/mL人表皮生長(zhǎng)因子、10-15ng/mL血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、兩性霉素2.5-5μg/ml、MEM培養(yǎng)基0.2-0.5mg/L及F12培養(yǎng)基0.1-0.25mg/L進(jìn)行配比，以制成所述培養(yǎng)基混合液；

S12、將具有熒光素酶的神經(jīng)母細(xì)胞瘤接種至所述培養(yǎng)基混合液重懸，在37℃、5％CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的神經(jīng)母細(xì)胞瘤原位模型的建立方法，其特征在于，所述S12中，具體包括：

S121、采集患者神經(jīng)母細(xì)胞瘤并通過(guò)100mL/L中性甲醛固定6～24h；

S122、通過(guò)經(jīng)常規(guī)組織處理進(jìn)行HE染色，在所述神經(jīng)母細(xì)胞瘤中至少具有50個(gè)橙綠信號(hào)總數(shù)時(shí)，確定為所述具有熒光素酶的神經(jīng)母細(xì)胞瘤；

S122、將所述具有熒光素酶的神經(jīng)母細(xì)胞瘤接種至所述培養(yǎng)基混合液重懸，并37℃、5％CO2的環(huán)境中進(jìn)行傳代培養(yǎng)3-4天，使其傳代至10-20代。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)母細(xì)胞瘤原位模型的建立方法，其特征在于，所述S20中，具體包括：將培養(yǎng)后的所述神經(jīng)母細(xì)胞瘤通過(guò)PBS緩沖液漂洗，并注入消化液消化成單細(xì)胞，將所述單細(xì)胞離心之后再采用所述PBS緩沖液漂洗，以制成所述細(xì)胞懸液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的神經(jīng)母細(xì)胞瘤原位模型的建立方法，其特征在于，所述單細(xì)胞的離心條件為：800rpm離心6min。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的神經(jīng)母細(xì)胞瘤原位模型的建立方法，其特征在于，所述消化液中含有0.1％濃度的膠原酶和0.25％胰酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)母細(xì)胞瘤原位模型的建立方法，其特征在于，所述S30中，具體包括：

S31、將所述C57BL/6小鼠的顱骨周邊緩慢注入0.35-0.55ml所述細(xì)胞懸液，并進(jìn)行消毒；

S32、將所述C57BL/6小鼠在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)4-5周；

S33、在培養(yǎng)后通過(guò)預(yù)定的體積計(jì)算公式計(jì)算所述C57BL/6小鼠的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的體積k，以判斷所述體積k是否處于2.2cm³至3.5cm³之間。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)母細(xì)胞瘤原位模型的建立方法，其特征在于，所述預(yù)定的體積計(jì)算公式為：

其中，v_n表示單個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的體積，L_n單個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的最長(zhǎng)直徑，W_n表示單個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的最長(zhǎng)橫徑。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)母細(xì)胞瘤原位模型的建立方法，其特征在于，所述C57BL/6小鼠為雌性、4周齡、重量為13-15g。