[發明專利]AOX特異性抗體組合及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 202011079775.4
• 申請日: 2020-10-10
• 公開（公告）號: CN112142846B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 王丹鳳;付愛根;王春宇
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40;C07K16/06;C12N15/13;C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;G01N33/573
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發明涉及植物細胞技術領域，具體公開了AOX特異性抗體組合及其制備方法和用途，所述AOX特異性抗體組合包含AOX1a、AOX1b/c、AOX1d和AOX2四個抗體。本發明獲得的AOX特異性抗體組合靈敏度很高，四個AOX特異性抗體能夠分別檢測植物中蛋白序列高度相似的AOX蛋白。

技術領域

本發明涉及植物細胞技術領域，具體涉及AOX特異性抗體組合及其制備方法和用途。

背景技術

光合作用是地球能量的主要來源，對光合作用的研究有助于提高農作物產量，也可能對能源短缺問題提供新的解決思路。植物光合作用涉及電子傳遞鏈，而AOX蛋白是交替氧化酶電子傳遞途徑的末端氧化酶，參與抗氰呼吸，在植物抵抗逆境脅迫過程中發揮著非常重要的作用，因此成為研究的熱點。

植物的線粒體中有五個AOX蛋白：AOX1a，AOX1b，AOX1c，AOX1d和AOX2。它們具有同源性，蛋白相似度很高。目前的研究集中在AOX1a，其他四個報道很少，AOX1a是主要的，相對來說表達量較大，另外四個則很難檢測，一般用的抗體都來自于UNIVERSITY OF NEBRASKA,LINCOHN，這是一個單克隆抗體，專一性很好，但這個抗體靈敏度很低，連AOX1a都難以檢測。

在檢測AOX表達的蛋白質免疫印跡實驗(Western Blot)中，首先要先提取細胞的膜蛋白，再用1:50的稀釋倍數的AOX抗體，才可以用Western Blot來顯示AOX1a，由于其他四個AOX的豐度要遠遠小于AOX1a，要檢測它們在植物中的水平就非常困難，并且這個抗體不能區分具體是哪種亞型的AOX，檢測到的是AOX家族的全體。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了AOX特異性抗體組合及其制備方法和用途，實現了高效檢測植物中所有的交替氧化酶，為涉及該蛋白領域的研究提供了有效的檢測工具。

本發明第一個目的是提供了AOX特異性抗體組合，所述AOX特異性抗體包含AOX1a、AOX1b/c、AOX1d和AOX2四個抗體；

所述抗體AOX1a對應抗原的基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示；

所述抗體AOX1b/c對應抗原的基因序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示；

所述抗體AOX1d對應抗原的基因序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示；

所述抗體AOX2對應抗原的基因序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。

本發明還提供了上述AOX特異性抗體組合的制備方法，包括如下步驟：

S1，目的基因序列的合成，所述目的基因分別為SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4：

S2，將S1合成的目的基因SEQ ID NO.1通過EcoRI和XhoI雙酶切連接構建到大腸桿菌表達載體pGEX4T.3載體上，然后通過在大腸桿菌中誘導蛋白表達，獲得AOX與GST的融合蛋白，標記為GST-AOX1a；

S3，將S2獲得的GST-AOX1a蛋白進行提純：

S4，將S3中提純的蛋白注射到兔子體內，進行4次免疫后，分離血清，獲得AOX特異性抗體AOX1a；

S5，分別合成目的基因SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.4，然后參照S2-S4的方法制備相應的AOX特異性抗體AOX1b/c，AOX1d，AOX2。

本發明的第三個目的是提供所述AOX特異性抗體組合在檢測植物交替氧化酶中的用途。

與現有技術相比，本發明的有益效果在于：