[發明專利]病毒BVDV、BRV和BCV一管多重熒光PCR檢測的專用引物及其應用

有效

• 申請號: 202011079561.7
• 申請日: 2020-10-10
• 公開（公告）號: CN112176105B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: 常麗云;劉志勇;秦建華;李穎;趙月蘭
• 申請（專利權）人: 河北農業大學;唐山市動物疫病預防控制中心（唐山市畜牧獸醫研究所）
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 李興林

本發明公開了病毒BVDV、BRV和BCV一管多重熒光PCR檢測的專用引物及其應用，屬于分子生物學檢測技術領域。本發明針對上述專用引物設計了最佳多重熒光PCR反應條件，上述引物和反應條件對BVDV、BRV和BCV的質粒標準品的最低檢出限分別為1.19×10²拷貝/μL、3.89×10¹拷貝/μL、3.74×10¹拷貝/μL，靈敏度最低比常規PCR高出100倍，靈敏性高；該方法僅特異擴增BVDV、BRV和BCV，與大腸桿菌、沙門氏菌、牛傳染性鼻氣管炎病毒無交叉反應，特異性強；組內變異系數小于1％，組間變異系數小于1％，具有良好的重復性。

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測技術領域，尤其涉及病毒BVDV、BRV和BCV一管多重熒光PCR檢測的專用引物及其應用。

背景技術

近幾年來，隨著奶牛養殖業規模擴大，犢牛腹瀉發病率呈逐年上升趨勢，犢牛腹瀉嚴重影響犢牛早期的生長發育及后期生產性能的穩定性，死亡率高達90％，嚴重影響牛群的擴增及奶牛養殖業的良性發展。引起犢牛腹瀉的因素錯綜復雜，其中傳染性病毒引起的腹瀉最為嚴重，且多呈混合性感染，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛輪狀病毒(BRV)和牛冠狀病毒(BCV)是最常見的病原。在臨床診斷過程中這三種病因具有比較相似的臨床癥狀且?；旌细腥荆瑢τ诓≡_診造成了很大難度，且傳播快、危害大、無特效藥物治療，給奶牛業造成巨大的經濟損失。

目前BVDV、BRV和BCV的診斷方法主要包括病原體細胞分離、電鏡技術、單一PCR、多重PCR、ELISA、基因芯片、環介導等溫擴增等方法，但上述檢測方法都具有明顯的局限性。實時熒光定量PCR操作簡單、靈敏度較高、具有良好的重復性、耗時短等優點，在實驗室的檢測中得到了廣泛的應用。實時熒光定量PCR有熒光染料法和TaqMan探針法兩種，最常用熒光染料法，可進行多重基因檢測，可滿足同一反應管檢測多種核酸序列的要求，耗時更短，同時熒光定量PCR克服了常規PCR在靈敏度、效率和病原含量測定等方面存在的不足。因而亟需建立一種可以同時檢測以上三種病原的多重熒光定量PCR的方法，為疾病的防控提供一定的幫助。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了病毒BVDV、BRV和BCV一管多重熒光PCR檢測的專用引物。

本發明分別參考GenBank中的BVDV E2基因、BRVVP6基因和BCVN基因的高度保守序列設計出以下特異性引物：

BVDV上游引物SEQ ID NO.1：5’-GGTCATAGCTCTCGACACCA-3’；

BVDV下游引物SEQ ID NO.2：5’-GAGCACGTATCTACCACCCA-3’；

BRV上游引物SEQ ID NO.3：5’-AGACAAAGAACGGGTTTCACA-3’；

BRV下游引物SEQ ID NO.4：5’-AGTCAAATCCAGCGACCTGA-3’；

BCV上游引物SEQ ID NO.5：5’-GCGTCCTCTGGAAATCGTTC-3’；

BCV下游引物SEQ ID NO.6：5’-AGCAGTTTGCTTGGGTTGAG-3’。

利用上述引物進行一管多重熒光PCR的反應體系為25μL：PerfectStartTM GreenSuperMix 12.5μL，BVDV、BRV、BCV上下游引物各0.5μL，檢測樣品1.0μL，去離子水3.5μL。

進一步的，所述一管多重熒光PCR的反應程序為95℃5min，95℃20s，55℃20s，72℃20s，共45個循環。

更進一步的，進行一管多重熒光PCR時設置無菌水為陰性對照。

本發明還提供了上述專用引物在制備檢測病毒BVDV、BRV和BCV產品中的應用。