[發明專利]一種提高菌株產精氨酸能力穩定性的方法

在審

• 申請號: 202011079224.8
• 申請日: 2020-10-10
• 公開（公告）號: CN114317582A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 楊晟;蔣宇;張姣;董楓
• 申請（專利權）人: 中國科學院分子植物科學卓越創新中心
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C12N15/66;C12N15/54;C12N15/31;C12N15/10;C12N1/21;C12P13/10;C12R1/15
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 賈師英

本發明公開了一種提高菌株產精氨酸能力穩定性的方法，包括以下步驟：以產L?精氨酸的谷氨酸棒桿菌為基礎菌株，對基因組中基因NCgl2644/cg3035進行失活或減弱。本發明的方法能夠有效提高L?精氨酸生產菌株的遺傳穩定性。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體地說，涉及一種提高菌株產精氨酸能力穩定性的方法，尤其涉及一種通過基因工程提高精氨酸生產菌遺傳穩定性的方法。

背景技術

L-精氨酸(L-argnine，簡稱L-Arg)是人體內所需半必需堿性氨基酸之一，作為一種含有胍基的堿性氨基酸，是生物體尿素循環的一種重要中間代謝物，具有多種獨特的生理和藥理作用，對于治療生理功能、心血管疾病、激勵免疫系統、維持嬰兒的營養平衡、促進人體解毒等都具有良好的療效，被專家稱為是機體內運輸和貯存氨基酸的重要載體，在肌內代謝中極為重要。它是合成胞漿蛋白和核蛋白的必需氨基酸；作為唯一的氨來源參與肌酸的合成；作為尿素循環的重要中間體，在肝臟中扮演著排除多余氨的角色，防止氨過量積累而引起中毒；它還具有調節人體免疫力的功能，可抑制腫瘤生長、促進受傷組織愈合等。并且，精氨酸是一氧化氮、尿素、鳥氨酸及肌丁胺的直接前體，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。因此，L-精氨酸在醫藥、食品及化工領域方面具有重要而廣泛的應用。比如，在臨床上，除作為復方氨基酸輸液的主要組分之一外，L-精氨酸及其鹽類還廣泛用于治療各類肝昏迷忌用谷氨酸鈉者和病毒性肝類谷丙轉氨酶異常者，對病毒性肝炎療效顯著。對腸道潰瘍、血栓形成和神經衰弱等癥都有治療效果。另外，L-精氨酸是運動營養飲料配方的重要組成部分，也是一種重要的飼料添加劑，還廣泛地應用于高端養殖業。據統計，目前全世界L-精氨酸需求量在15000噸以上，并且需求量以每年12％-15％的速度增長。

L-精氨酸的生產方法有兩種：一是蛋白質水解提取法，二是微生物發酵法。水解法存在操作費時，收率和產量低，成本高等問題，并且存在嚴重的污染，因而不適合大規模生產。發酵法生產L-精氨酸工藝相對簡單，且對環境友好，因此具有很大的發展潛力，成為國內外氨基酸工業的一個重要發展趨勢。國際上著名的氨基酸公司比如日本味之素、協和發酵和德國迪高沙主要采用生物發酵和基因工程技術進行L-精氨酸生產。但是，國內的微生物發酵生產L-精氨酸的產酸水平普遍較低，成本較高，生產水平和產量遠遠不能滿足國內需求，因此提高L-精氨酸發酵水平的研究具有重要的意義。

L-精氨酸的發酵菌種研究得較多的主要有谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、鈍齒棒桿菌(Corynebacteriumcrenatum)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等，但目前用來生產L-精氨酸的微生物菌株主要是谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌。基因工程技術對于精氨酸高產菌選育具有重要的推動作用，利用基因工程構建L-精氨酸高產菌株是一種高效率、理性化的育種手段。

然而，許多基因工程菌的遺傳性狀不穩定，分泌產生精氨酸的能力不穩定，導致發酵批次差異大，傳代后會發生退化變異現象，甚至經數次傳代后就失去產精氨酸能力，造成工業規模生產應用的困難。例如，發明人以野生型谷氨酸棒桿菌ATCC13032為出發菌株，敲除argR，解除argB反饋抑制引入argB的(A26V M31V)突變獲得基因工程菌株編號1441(基因型ATCC13032ΔargRargB^A26VM31V)，大大提高了谷氨酸棒桿菌生產精氨酸的能力，精氨酸產量為6.231±0.023g/L，但是后續實驗發現，該基因工程菌株十分不穩定，發酵批次差異大，傳代后即失去產精氨酸的能力(編號1442即從編號1441菌株傳一代后獲得的菌株)。因此提高精氨酸工程菌株的遺傳穩定性始終是一種迫切的需求。

發明內容

為了克服現有L-精氨酸生產菌株遺傳性狀不穩定、發酵水平低的缺陷，本發明利用基因工程技術來改造谷氨酸棒桿菌包括谷氨酸棒桿菌工程菌的基因組，并且通過增強與L-精氨酸產生相關的基因、弱化分支代謝途徑，能夠大幅度提高菌株的遺傳穩定性和L-精氨酸生產能力。