[發明專利]一種多功能抗GFAP單克隆抗體的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202011076515.1
• 申請日: 2020-10-10
• 公開（公告）號: CN112175079A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 徐婭;袁文文;于倩;李晶晶;張芳;易汪雪
• 申請（專利權）人: 武漢華美生物工程有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/85
• 代理公司: 北京眾達德權知識產權代理有限公司 11570
• 代理人: 梁凱

本發明公開了一種多功能抗GFAP單克隆抗體的制備方法及其應用，屬于生物技術領域。一種多功能抗GFAP單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：S1，進行鼠單抗制備；S2，加入5mL的DMEM培養基混勻；S3，進行腹水制備；S4，抗體純化；S5，進行重組抗體制備，首先進行RNA提取；S9，進行cDNA制備，然后進行質粒制備；S10，抗GFAP重組抗體表達及純化，包括轉染前細胞培養、轉染細胞的準備、瞬時轉染和產物表達與檢測；S11、進行抗體驗證；本發明與傳統單克隆抗體相比，重組抗體具有序列已知、抗體基因可長期保存、抗體性質穩定、實驗重復性好等優點，是一種標準化的抗體生產流程，回避了傳統單克隆抗體生產保存過程中出現的風險因素。

技術領域

本發明涉及生物技術技術領域，尤其涉及一種多功能抗GFAP單克隆抗體的制備方法及其應用。

背景技術

GFAP是膠質纖維酸性蛋白是星形膠質細胞活化的標志物，神經膠質纖維酸性蛋白是一種Ⅲ型中間絲狀蛋白，以單體形式存在，星形膠質細胞廣泛分布于中樞神經系統各個部位，約占正常成年人腦細胞總數的40％，GFAP則是星形膠質細胞特有的中間絲蛋白，研究發現星形膠質細胞在發育成熟后GFAP表達明顯增加并貫穿一生，GFAP小鼠中，星形膠質細胞的中間絲顯著減少甚至完全沒有。因此GFAP不僅被認為是星形膠質細胞的成熟標志，也成為正常及病理情況下應用最廣泛的星形膠質細胞標記物。正常情況下，在細胞胞質內的GFAP循環降解，血液中GFAP水平較穩定；然而病理條件下，如病人的中樞神經系統受到損傷，其星形膠質細胞遭受破傷或壞死時，GFAP從膠質細胞中流出，穿過血腦屏障進入血液中，使GFAP濃度上調。

目前市場上抗GFAP單抗產品數量較少，從市面上已經制備成功的例子來看，免疫原多為天然蛋白，也有大腸和293T細胞表達。市面上該項目產品可分為鼠單抗和兔單抗。市面上抗GFAP單克隆抗體應用也相對較少，其中在WB、IHC、IF、FC等實驗中一般只通過一至兩種驗證。GFAP單抗是干細胞單克隆抗體中的一個重要項目，但是目前通過了FC驗證的產品僅兩個，FC區分度在10倍左右。

傳統單克隆抗體，可以通過相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體，且可通過不同篩選手段，獲得不同表型的特異性抗體。雜交瘤細胞具有無限增殖能力，理論上可以一直使用，不斷產生完全相同的單抗，但實際在長期使用后雜交瘤細胞存在退化的情況，效價會下降，另外可能由于保存等原因，細胞株存在抗體染色體丟失、細胞復蘇后停止生長或者死亡等風險。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術中的問題，而提出的一種多功能抗GFAP單克隆抗體的制備方法及其應用。

為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：

一種多功能抗GFAP單克隆抗體，其含有由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4所示的CDR1、由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示的CDR2以及由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示的CDR3。

優選的，該抗體可以特異性識別GFAP蛋白。

優選的，該抗體可以應用于抗體驗證。

一種制備多功能抗GFAP單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

S1，進行鼠單抗制備，首先快速將細胞凍存管從液氮罐中取出，置37℃恒溫水浴鍋內快速搖晃至細胞融化；

S2，加入5mL的DMEM培養基混勻，在超凈臺操作，1200rpm離心5min，棄上清，加入20％完全培養基，37℃5％CO₂培養箱內培養，傳代培養；

S3，進行腹水制備；

S4，抗體純化；

S5，進行重組抗體制備，首先進行RNA提取，復蘇細胞，然后檢測細胞株效價，采用半皿或者1/4皿收集細胞；