[發(fā)明專利]一種基于顆粒計數(shù)的均相反應體系、方法及應用

在審

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• 申請日: 2020-10-10
• 公開（公告）號: CN114324853A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設計）人: 陳翊平;王知龍;董永貞
• 申請（專利權）人: 武漢生之源生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/544;G01N33/569;G01N33/68;G01N15/10
• 代理公司: 北京天奇智新知識產(chǎn)權代理有限公司 11340
• 代理人: 楊文錄

本發(fā)明公開了一種基于顆粒計數(shù)的均相反應體系、方法及應用，涉及食品安全、體外診斷和環(huán)境監(jiān)測領域，該體系包括絕緣微球，絕緣微球的表面偶聯(lián)有生物配體，生物配體為與目標物相對應的抗體、完全抗原、核酸適配體或DNA探針；提供目標物與微球?生物配體反應的載體；用于測定顆粒物粒徑和數(shù)量的顆粒計數(shù)器；微球?生物配體與目標物反應后，反應體系中存在未反應的微球?生物配體、微球?生物配體?目標物或/和粒徑＞微球?生物配體的復合物，其中，微球?生物配體、微球?生物配體?目標物和微球的粒徑相當，使用顆粒計數(shù)器對反應后粒徑與微球粒徑相當?shù)奈镔|數(shù)量進行測定，確定目標物濃度。本發(fā)明的檢測成本較低，速度較快。

技術領域

本發(fā)明涉及食品安全、體外診斷和環(huán)境監(jiān)測領域，具體涉及一種基于顆粒計數(shù)的均相反應體系、方法及應用。

背景技術

食品安全、體外診斷和環(huán)境監(jiān)測通常需要對細菌、核酸、病毒、生物標記物、藥物殘留等目標物進行檢測，準確、快速的檢測手段能夠有效地降低食品安全事故的發(fā)生率，提高診斷準確率，提高環(huán)境防控能力。

目前主要通過儀器分析方法、基于堿基互補配對的分子診斷方法和基于抗原-抗體相互作用的免疫分析法來對細菌、核酸、病毒、生物標記物、藥物殘留等目標物進行檢測。

其中，儀器分析法具有準確性好、靈敏度高的優(yōu)點，但是，分析儀器的成本較高，且需要對目標物進行繁瑣的樣品前處理，需要專業(yè)操作人員操作，使得檢測過程耗時長、成本高，無法滿足大樣本即時篩查的需求；目前的分子診斷方法主要采用熒光定量PCR(實時熒光定量聚合酶鏈式反應)，但熒光定量PCR儀設備昂貴，檢測速度較慢，需要專業(yè)人員操作，檢測難度較大，檢測成本較高。

免疫分析法通常包括免疫層析法、酶聯(lián)免疫法和均相免疫法，免疫層析法具有檢測速度快、成本低、操作簡便等優(yōu)點，但存在靈敏度和準確性較低等缺點；酶聯(lián)免疫法具有靈敏度較高、高通量、操作相對簡便等優(yōu)勢，但需要多步操作、多步洗滌，耗時耗力；均相免疫法相對酶聯(lián)免疫法具有操作簡便、不需要洗滌步驟、速度快的優(yōu)點，只需要將樣品和相關反應試劑混勻、反應之后就可以直接讀取結果，但是目前常見的均相免疫反應信號的讀出往往依賴于光學信號或磁信號，導致反應的穩(wěn)定性較低，成本較高。

申請人前期的一項發(fā)明專利報道了一種基于電阻微米孔數(shù)字計數(shù)的分析方法，其表明電阻微米孔顆粒計數(shù)是一種有效的信號讀出模式，可以很好地分辨出絕緣微球的數(shù)量和粒徑，結合免疫反應和DNA分子擴增、雜交等技術可以構建一系列靈敏度高、穩(wěn)定性好的分析方法，在食品安全檢測、體外診斷、環(huán)境監(jiān)測等領域具有很好的應用前景。但該方法需要以納米磁顆粒作為磁分離的載體，需要多步洗滌，檢測成本較高，速度較慢。

發(fā)明內容

針對現(xiàn)有技術中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種基于顆粒計數(shù)的均相反應體系、方法及應用，檢測成本較低，速度較快。

為達到以上目的，本發(fā)明采取的技術方案是：

一種基于顆粒計數(shù)的均相反應體系，包括：

相同粒徑的絕緣微球，所述絕緣微球的表面偶聯(lián)有生物配體，即微球-生物配體，所述生物配體為與目標物相對應的抗體、完全抗原、核酸適配體或DNA探針；

反應載體，其用于提供目標物與偶聯(lián)有生物配體的絕緣微球相互反應的空間；

顆粒計數(shù)器，其用于對反應前后體系中物質的粒徑和數(shù)量進行測定，并以此確定目標物濃度；

所述微球-生物配體與目標物反應后，反應體系中存在以下兩種粒徑分布：a、未反應的微球-生物配體，粒徑和絕緣微球-生物配體相當?shù)奈⑶?生物配體-目標物；b、未反應的微球-生物配體，粒徑＞微球-生物配體的微球-生物配體-目標物-生物配體-微球或/和微球-抗體-完全抗原-微球復合物；

使用顆粒計數(shù)器對反應前后體系中粒徑與微球-生物配體粒徑相當?shù)奈⑶驈秃衔飻?shù)量進行測定，確定目標物濃度。