[發明專利]一種基于顆粒計數的均相反應體系、方法及應用

在審

• 申請號: 202011076429.0
• 申請日: 2020-10-10
• 公開（公告）號: CN114324853A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 陳翊平;王知龍;董永貞
• 申請（專利權）人: 武漢生之源生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/544;G01N33/569;G01N33/68;G01N15/10
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 楊文錄

1.一種基于顆粒計數的均相反應體系，其特征在于，包括：

相同粒徑的絕緣微球，所述絕緣微球的表面偶聯有生物配體，即微球-生物配體，所述生物配體為與目標物相對應的抗體、完全抗原、核酸適配體或DNA探針；

反應載體，其用于提供目標物與偶聯有生物配體的絕緣微球相互反應的空間；

顆粒計數器，其用于對反應前后體系中物質的粒徑和數量進行測定，并以此確定目標物濃度；

所述微球-生物配體與目標物反應后，反應體系中存在以下兩種粒徑分布：a、未反應的微球-生物配體，粒徑和絕緣微球-生物配體相當的微球-生物配體-目標物；b、未反應的微球-生物配體，粒徑＞微球-生物配體的微球-生物配體-目標物-生物配體-微球或/和微球-抗體-完全抗原-微球復合物；

使用顆粒計數器對反應前后體系中粒徑與微球-生物配體粒徑相當的微球復合物數量進行測定，確定目標物濃度。

2.如權利要求1所述的一種基于顆粒計數的均相反應體系，其特征在于：所述目標物為農獸藥/真菌毒素小分子、蛋白質、DNA結構、病毒或細菌。

3.如權利要求2所述的一種基于顆粒計數的均相反應體系，其特征在于：當所述目標物為農獸藥/真菌毒素小分子時，生物配體為相對應的抗體和完全抗原，在一部分絕緣微球表面偶聯抗體，形成微球-抗體，另一部分絕緣微球表面偶聯完全抗原，形成微球-完全抗原；

反應時，目標物、微球-完全抗原均能與微球-抗體作用，發生均相競爭免疫反應，反應完成后混合液中為“微球-完全抗原-抗體-微球”復合物，“微球-抗體-目標物”復合物，未反應的微球-抗體或微球-完全抗原；

其中，“微球-完全抗原-抗體-微球”復合物的粒徑遠大于未反應微球-抗體、微球-完全抗原和“微球-抗體-目標物”復合物，通過顆粒計數器的粒徑分析功能可以識別，以未反應微球-抗體、微球-完全抗原和“微球-抗體-目標物”復合物作為計數目標，根據計數目標的顆粒數，可計算目標物的濃度。

4.如權利要求2所述的一種基于顆粒計數的均相反應體系，其特征在于：當目標物為蛋白質分子時，在一部分微球表面修飾與目標物相對應的捕獲抗體，另一部分微球表面修飾相對應的檢測抗體；反應時微球-檢測抗體、微球-捕獲抗體均與目標物作用，發生“雙抗夾心”均相免疫反應；

反應完成后，溶液中存在“微球-檢測抗體-目標物-捕獲抗體-微球”復合物、未反應的微球-檢測抗體或微球-捕獲抗體，其中，“微球-檢測抗體-目標物-捕獲抗體-微球”復合物的粒徑遠大于未反應微球-檢測抗體或/和微球-捕獲抗體，通過顆粒計數器的粒徑分析功能可以識別，以未反應微球-檢測抗體或/和微球-捕獲抗體作為計數目標，根據計數目標的顆粒數，可計算目標物的濃度。

5.如權利要求2所述的一種基于顆粒計數的均相反應體系，其特征在于：當目標物為DNA分子結構時，在一部分微球表面修飾與目標物相應的DNA捕獲探針，另一部分微球表面修飾與目標物相對應的DNA檢測探針；反應時，微球-DNA捕獲探針、微球-DNA檢測探針與目標物發生均相雜交反應；

反應完成后，溶液中存在“微球-DNA捕獲探針-目標物-DNA檢測探針-微球”復合物和未反應的微球-DNA捕獲探針和/或微球-DNA檢測探針，“微球-DNA捕獲探針-目標物-DNA檢測探針-微球”的粒徑遠大于未反應的微球-DNA捕獲探針和/或微球-DNA檢測探針，通過顆粒計數器的粒徑分析功能可以識別，因此，以未反應微球-DNA捕獲探針和/或微球-DNA檢測探針作為計數目標，根據計數目標的顆粒數，可計算目標物的濃度。

6.如權利要求1所述的一種基于顆粒計數的均相反應體系，其特征在于：所述反應載體包括微流控芯片和普通反應容器。

7.如權利要求6所述的一種基于顆粒計數的均相反應體系，其特征在于：所述微流控芯片包括加樣口、微泵、微管道、出樣口，其中芯片微管道的直徑為100μm～1000μm，高度為100μm～1000μm，微管道反應結構可為螺旋式或折疊式。