[發明專利]一種雙發夾連接介導恒溫擴增的核酸檢測新方法

有效

• 申請號: 202011073243.X
• 申請日: 2020-10-09
• 公開（公告）號: CN112159836B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 李冰凌;李歡;唐藝丹;呂佰陽
• 申請（專利權）人: 中國科學院長春應用化學研究所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 潘穎

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種雙發夾連接介導恒溫擴增的核酸檢測新方法。該檢測體系由探針A鏈、探針B鏈和擴增引物組成，包括連接和擴增兩步反應。與傳統等溫擴增檢測方法不同，本發明方法適用于包括小RNA(例如miRNAs)在內的不同長度的核酸檢測，具有較好的普適性，應用廣泛；且該方法設計簡單，針對不同的靶標檢測，可通用一套擴增引物，有效避免了繁雜的條件優化過程，操作簡單，具有零背景、高靈敏度和高選擇性的特點。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種雙發夾連接介導恒溫擴增的核酸檢測方法。

背景技術

高效精準的核酸檢測技術在傳染病原檢測、食品安全檢疫和致病基因篩查等方面具有極為重要的作用。其中，聚合酶鏈式反應(PCR)使用最為廣泛，在循環溫度和聚合酶的輔助下，其能將低至單分子的片段在一小時內復制10⁹倍，達到儀器檢出水平。近年來，為降低核酸檢測對嚴苛控溫和精密儀器的依賴，發生在恒定溫度下的擴增反應被視為PCR的有力替代者，更有希望實現免儀器的便攜性檢測。這些方法被稱為“等溫核酸擴增技術”，包括依賴于核酸序列擴增(NASBA)、鏈替換擴增(SDA)、環介導等溫擴增(LAMP)、解旋酶替換擴增(HDA)、重組酶復制擴增(RPA)等。然后，以上這些等溫擴增方法大多只能直接擴增DNA，在擴增RNA時必須要加入逆轉錄步驟，此外由于引物設計等因素，靶標僅限于較長片段(大于100bp)的DNA和RNA，小片段核酸例如microRNAs(miRNAs)由于序列較短，僅包含18-22nt，引物設計靈活性差，缺少相應的擴增方法。大量研究發現miRNAs在各種癌癥當中表達異常，與腫瘤的發生，發展和治療密切相關，因此，miRNAs成為腫瘤檢測和預后的重要生物標記物，miRNAs的檢測日益重要。

最近，有研究表明通過改良傳統恒溫擴增反應來檢測miRNA，以增加其通用性。第一種方法直接將靶標用作傳統等溫擴增反應的引物。Yan等人巧妙地將miRNA用作LAMP的外部引物F3，并通過熒光信號定量檢測miRNA。然而，由于LAMP模板一直存在于反應系統中，該方法的背景信號相對較高，導致信噪比較低。另一種方法是基于連接酶的擴增反應，其中最為代表性的是RCA反應，其通過連接反應環化與靶標雜交的鎖式探針。這種類型的等溫擴增反應可以檢測不同長度的核酸，但是為了促進聚合酶與鎖式探針結合，靶標的游離端必須靠近掛鎖探針雜交的位置，否則擴增效率將大大降低，這大大限制了靶向范圍。此外，未成環的鎖式探針和未結合探針的靶標會產生較高的背景信號，導致信噪比低。盡管可以利用外切酶消除未成環的鎖式探針和未結合探針的靶標，但核酸外切酶的引入不僅提高了操作繁瑣程度，還大大增加了反應時間，導致其實用性降低。綜上所述，亟需一種簡單且實用的等溫放大方法，使其能夠高靈敏、零背景的檢測包括小RNA片段在內的核酸。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種雙發夾連接介導恒溫擴增的檢測新方法。該方法不僅適用于小RNA(miRNAs)，同時能用于長鏈RNA和DNA的檢測，原始模板不存在于體系中，故背景泄露低，具有高選擇性。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種雙發夾連接介導恒溫擴增的檢測探針及引物組，檢測探針及引物組由探針A鏈、探針B鏈、擴增引物組成；

探針A鏈從5’端開始依次包括1域、2域、α域、3域、1*域、4域、5域、6域及β1域，3’端含OH；α域為信號位點，β1域為第一識別位點；

探針B鏈從5’端開始依次包括β2域、7域及5*域，5’端帶磷酸基團；β2域為第二識別位點；