[發明專利]一種雙發夾連接介導恒溫擴增的核酸檢測新方法

有效

• 申請號: 202011073243.X
• 申請日: 2020-10-09
• 公開（公告）號: CN112159836B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 李冰凌;李歡;唐藝丹;呂佰陽
• 申請（專利權）人: 中國科學院長春應用化學研究所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 潘穎

1.一種雙發夾連接介導恒溫擴增的檢測探針及引物組組合，其特征在于，所述檢測探針及引物組由探針A鏈、探針B鏈、擴增引物組成；

所述探針A鏈從5’端開始依次包括1域、2域、α域、3域、1*域、4域、5域、6域及β1域，3’端含OH；所述α域為信號位點，所述β1域為第一識別位點；

所述探針B鏈從5’端開始依次包括β2域、7域及5*域，5’端帶磷酸基團；所述β2域為第二識別位點；

其中，1域與1*域堿基互補，5域與5*域堿基互補；探針A鏈與探針B鏈可通過上述堿基互補配對形成待連接的單發夾探針，該單發夾探針通過第一識別位點和第二識別位點與靶標RNA堿基互補，從而拉近5’端磷酸基團和3’端羥基形成缺口，在連接酶的作用下形成包含信號位點和識別位點的可擴增的雙發夾結構；

所述擴增引物包括引物FP、引物RP和引物LP；

引物FP和RP均包含兩個域，RP用于結合探針B鏈的5*域和7域，FP用于結合1域和2域的互補區域，先后引發擴增；

引物LP用于結合探針A鏈和探針B鏈上除去FP和RP結合之外的環及環的互補序列。

2.根據權利要求1所述的檢測探針及引物組組合，其特征在于，所述探針A鏈從5’端開始依次包括SEQ ID NO：1所述序列或SEQ ID NO：3所述序列中任一序列，及第一識別位點；

所述探針B鏈從5’端開始依次包括第二識別位點和SEQ ID NO：2所述序列。

3.根據權利要求1所述的檢測探針及引物組組合，其特征在于，

靶標RNA為長鏈RNA中的片段1，探針A鏈序列如SEQ ID NO：12所示，探針B鏈序列如SEQID NO：15所示，引物LP序列如SEQ ID NO：18所示；

靶標RNA為長鏈RNA中的片段4，探針A鏈序列如SEQ ID NO：13所示，探針B鏈序列如SEQID NO：16所示，引物LP序列如SEQ ID NO：19所示；

靶標RNA為長鏈RNA中的片段6，探針A鏈序列如SEQ ID NO：14所示，探針B鏈序列如SEQID NO：17所示，引物LP序列如SEQ ID NO：20所示。

4.根據權利要求1至3中任一項所述的檢測探針及引物組組合，其特征在于，所述檢測探針及引物組還包括信號輸出探針序列，所述信號輸出探針序列為OSD探針序列。

5.根據權利要求4所述的檢測探針及引物組組合，其特征在于，所述OSD探針序列5’端修飾有熒光基團。

6.根據權利要求5所述的檢測探針及引物組組合，其特征在于，所述熒光基團為FAM、BHQ1或ROX中的一種。

7.一種非診斷目的的雙發夾連接介導恒溫擴增的核酸檢測方法，其特征在于，采用權利要求1至6中任一項所述檢測探針及引物組擴增靶標RNA，包括如下步驟：

針對RNA，將探針A鏈、探針B鏈混合，于95 ℃孵育5 min后，以0.1 ℃/s降至室溫，用于形成SHP，向混合液中加入靶標RNA，于65 ℃孵育5 min后，以0.1 ℃/s降至室溫，形成三鏈雜交體；

隨后將上述三鏈雜交體混合液加入連接反應體系中進行連接，然后失活連接酶；

將連接產物加入擴增反應體系中進行擴增，檢測擴增的核酸含量。

8.根據權利要求7所述的核酸檢測方法，其特征在于，針對RNA，所述連接反應體系包括：連接酶5%，連接酶緩沖液10%，RNA inhibitor2.5%，三鏈雜交體20%；

連接反應程序為：于30℃反應30min。

9.根據權利要求7或8所述的核酸檢測方法，其特征在于，所述擴增反應體系如下：

探針A鏈，在體系中最終濃度為80pM 或640 pM；

探針B鏈，在體系中最終濃度為80 pM或640pM；

2 μL引物混合液，[FP]=[RP]=0.8 μM=2[LP]；

1 μL 10 mM dNTPs，0.5 μL 100 mM Mg²⁺，5 μL 5 M betaine；

2.5 μL 熒光探針混合液，包含50 nM 熒光探針和100 nM 猝滅探針；

反應緩沖液補足至25 μL；

擴增反應程序為：于63 ℃反應。