[發明專利]一種評價轉基因外源蛋白對蠐螬影響的生物檢測方法

有效

• 申請號: 202011069964.3
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112335609B
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 方志翔;劉標;沈文靜;張莉;劉來盤;劉國強
• 申請（專利權）人: 生態環境部南京環境科學研究所
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033;A23K50/90;A23K20/147;A23K10/37
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

本發明公開評價轉基因外源蛋白對蠐螬影響的生物檢測方法，配制轉基因外源蛋白稀釋液；將玉米芯粉碎研磨，高溫高壓滅菌得到玉米芯粉末；將玉米芯粉末加入到蛋白稀釋液中，在離心管中充分震蕩混勻，靜置，離心，取出上清液；將上清液重新加入離心管，重復多次；最后離心得到的沉淀即為吸附好蛋白的玉米芯粉；取蠐螬置于底部鋪滿土壤的小燒杯中，飼喂吸附好蛋白的玉米芯粉、空白玉米芯粉以及辛硫磷乳油浸泡后的玉米芯粉組，置于培養箱中飼養，觀察蠐螬存活情況與體重變化情況評價轉基因外源蛋白對蠐螬的影響。本發明對尚未應用于作物的多種新型轉基因外源蛋白均能夠有效檢測其對蠐螬的影響，具有很強的實用性。

技術領域

本發明屬于轉基因植物環境安全評價技術領域，具體涉及一種評價轉基因外源蛋白對蠐螬影響的生物檢測方法。

背景技術

截至2018年共有70個國家種植或進口了轉基因作物，這已是全球連續應用轉基因作物的第23個年頭。26個國家共種植了1.917億公頃轉基因作物，比2017年的種植面積增加了190萬公頃。世界轉基因棉花種植面積已約2500萬公頃，占所有棉花種植的78％，這其中帶有Bt基因的棉花占據相當比例。在中國，轉基因棉花和番木瓜也早已實現了大規模商業化種植，產生了良好的生態和經濟效益。但關于轉Bt基因作物對非靶標動物的安全性一直存在爭論，因此對于轉基因作物的非靶標動物的生物檢測，是轉基因作物安全評價工作中非常重要的環節。

蠐螬是金龜甲的統稱。鞘翅目，金龜子總科。在中國漢初解釋詞義的專著《爾雅》中即有記載。全世界已知數萬種，中國已記載約1000余種。是重要地下害蟲也是是土壤生態環境中重要的食物鏈環節和土壤代謝的參與者。此外某些種類的蠐螬可入藥，對人類有益。近年來，蠐螬的經濟價值逐漸被開發，其體內富含多種營養物質，被譽為“蛋白質飼料寶庫”，成為新興的經濟昆蟲，飼養規模逐漸擴大。

對于已經商業化的轉基因作物，我們用其莖葉組織喂飼蠐螬，可以評價轉入的外源蛋白對蠐螬的影響。而對于大多數尚未轉入作物中的新型轉基因外源蛋白，無法采用飼喂莖葉的方法來評價其對蠐螬的影響。因此，建立適用于評價新型轉基因外源蛋白對蠐螬影響的生物檢測方法，是評價新型外源蛋白對蠐螬影響的重要手段，也是新型外源蛋白能否繼續下一步應用的關鍵環節。

發明內容

發明目的：為了能夠評價轉基因外源蛋白對于蠐螬的影響，本發明所要解決的技術問題是提供了一種評價轉基因外源蛋白對蠐螬影響的生物檢測方法。

技術方案：為了解決上述技術問題，本發明公開了一種評價轉基因外源蛋白對蠐螬影響的生物檢測方法，包括以下步驟：

1)配制轉基因外源蛋白稀釋液；

2)將玉米芯粉碎研磨成粒徑小于100微米的顆粒，用純凈水洗凈，高溫高壓滅菌得到玉米芯粉末；

3)將步驟2)處理好的玉米芯粉末加入步驟1)得到的蛋白稀釋液中，在離心管中充分震蕩混勻，靜置，離心，取出上清液；

4)將上清液重新加入步驟3)中的離心管，重復步驟3)多次；

5)最后離心得到的沉淀即為吸附好蛋白的玉米芯粉，取出備用；

6)上清液用于蛋白含量測定，以確定蛋白實際吸附量；

7)取蠐螬置于底部鋪滿土壤的小燒杯中，土壤為滅菌農田土或人造土壤，厚度2-5cm，飼喂吸附好蛋白的玉米芯粉、空白玉米芯粉以及辛硫磷乳油浸泡后的玉米芯粉組，置于培養箱中飼養，觀察蠐螬存活情況與體重變化情況評價轉基因外源蛋白對蠐螬的影響。

其中，所述步驟1)中的轉基因外源蛋白包括但不僅限于Cry 2Ab蛋白或Cry3A蛋白，其他的轉基因外源蛋白也可以用于該檢測方法。

其中，所述步驟1)中的轉基因外源蛋白的濃度為0.1～1mg/ml。

其中，所述步驟3)中的玉米芯粉末與蛋白稀釋液的固液比為1∶5～1∶20g/mL。