[發(fā)明專利]一種基于構(gòu)建雙功能酶合成PAPS的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011069389.7
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN113046402B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 康振;王陽;胥睿睿;堵國成;陳堅(jiān)
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12P19/32
• 分類號: C12P19/32;C12N9/12
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發(fā)明公開了一種基于構(gòu)建雙功能酶合成PAPS的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先對不同來源的ATP硫酸化酶和APS激酶進(jìn)行優(yōu)選，利用蛋白質(zhì)融合技術(shù)，將優(yōu)選所得的ATP硫酸化酶和APS激酶之間融合一段不同的蛋白接頭(linker)，構(gòu)建了雙功能PAPS合酶。進(jìn)一步對linker進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和改造，大大提高了轉(zhuǎn)化效率，并簡化了酶催化劑的獲取，減少酶催化劑在制備過程中的損失。使得ATP轉(zhuǎn)化率提高了25％，催化時間縮短59％。此外通過突變ATP硫酸化酶P環(huán)HRAH序列為HNGH和HAGH，進(jìn)一步提高其酶活，使得PAPS的轉(zhuǎn)化率可達(dá)48％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于構(gòu)建雙功能酶合成PAPS的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate，PAPS)是已知唯一有活性的硫酸基團(tuán)供體，是生物“活化”的硫酸鹽形式，是細(xì)胞對無機(jī)硫酸鹽的吸收和代謝至關(guān)重要的物質(zhì)。此外，已證實(shí)多種疾病的產(chǎn)生與發(fā)展會引起組織中PAPS含量的改變，如癌癥、HIV等。

PAPS是硫酸軟骨素、肝素和硫酸皮膚素等最直接的硫酸根供體。目前PAPS的主要來源為提取法和酶法合成。由于PAPS在大多數(shù)生物體內(nèi)直接含量少，使得提取PAPS工藝繁瑣，且副產(chǎn)物較多難以純化，直接導(dǎo)致PAPS的生產(chǎn)成本高昂。

酶法合成PAPS以腺苷三磷酸(Adenosine?triphosphate，ATP)和硫酸根為底物，經(jīng)ATP硫酸化酶和APS激酶催化合成PAPS。在反應(yīng)的第一步由ATP硫酸化酶生成腺苷磷酰硫酸(Adenosine?phosphosulfate，APS)和副產(chǎn)物焦磷酸，第二步反應(yīng)APS經(jīng)由APS激酶催化合成目的產(chǎn)物PAPS和副產(chǎn)腺苷二磷酸(Adenosine?diphosphate，ADP)。由于必然產(chǎn)生的副產(chǎn)物ADP，酶法合成PAPS的底物ATP理論轉(zhuǎn)化率為50％。在高等生物，如哺乳動物、海底蠕蟲等生物中，PAPS合成酶為雙功能酶，使得硫代謝更加多功能高效率。

由于目前PAPS的純化處起步階段，所得PAPS純度有限，直接導(dǎo)致純度較高的PAPS價(jià)格昂貴且限制了其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

[技術(shù)問題]

目前體外酶法合成PAPS主要為雙酶一鍋法，存在效率與轉(zhuǎn)化率低，成本高等缺點(diǎn)，不利于規(guī)?；a(chǎn)。

[技術(shù)方案]

本發(fā)明提供一種基于構(gòu)建雙功能酶合成PAPS的方法，是模仿高等生物生產(chǎn)PAPS的方式，也體現(xiàn)了高等生物體的一種進(jìn)化趨勢，利用不同的接頭序列將ATP硫酸化酶和APS激酶融合成一個雙功能蛋白，實(shí)現(xiàn)人工PAPS合成雙功能酶的構(gòu)建。這種將不穩(wěn)定的中間體導(dǎo)入雙功能酶反應(yīng)中的機(jī)制，極大的提高了底物ATP的轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化效率。且在實(shí)際生產(chǎn)中也簡化了多酶制備的步驟，降低生產(chǎn)成本。并通過突變ATP硫酸化酶保守區(qū)域P環(huán)HRAH序列為HNGH和HKGH，進(jìn)一步提高其催化活力。

本發(fā)明提供了一種合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的方法，利用PAPS合成雙功能酶，以ATP為底物，合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述PAPS合成雙功能酶是將ATP硫酸化酶和APS激酶通過融合接頭序列連接，得到ATP硫酸化酶和APS激酶的融合蛋白。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述融合接頭序列如SEQ?ID?NO:1～5所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述融合接頭序列可以重復(fù)多次，重復(fù)次數(shù)不超過6次。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述ATP硫酸化酶來源于乳酸克魯維酵母、釀酒酵母或產(chǎn)黃青霉菌。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述來源于乳酸克魯維酵母的ATP硫酸化酶Gene?ID為2894185；