[發明專利]一種基于高通量測序檢測膽管癌FGFR1/2/3融合基因的文庫構建方法

有效

• 申請號: 202011069119.6
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112144125B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 陳志宏;修陽斌;陳琰;康燦昆
• 申請（專利權）人: 廈門飛朔生物技術有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06;C12Q1/6806;C12Q1/6858;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 李興林

本發明公開了一種基于高通量測序檢測膽管癌FGFR1/2/3融合基因的文庫構建方法，屬于生物技術領域。該文庫構建方法包括如下步驟：(1)使用引物序列SEQ ID NO.1?67進行多重PCR擴增獲得文庫；(2)文庫的純化。該方法可用于定性檢測膽管癌患者包括手術切除的新鮮病理組織、甲醛固定石蠟包埋病例組織、石蠟切片等樣本中FGFR1/2/3基因融合的狀態，可檢測33種融合形式。該方法僅需要少量RNA逆轉錄成cDNA作為模板，在單管完成文庫的構建，操作簡單方便，僅需3.5個小時完成文庫構建，大大縮減了檢測成本。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種基于高通量測序檢測膽管癌FGFR1/2/3融合基因的文庫構建方法。

背景技術

膽管癌(cholangiocarcinoma)是起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤，其發生位置遍布于毛細膽管至膽總管。根據膽管癌的解剖學分類膽管癌分為肝內膽管癌(iCCA)、肝門部膽管癌(pCCA)和遠端膽管癌(dCCA)；其中pCCA和dCCA也可統稱為“肝外CCA(eCCA)，其中肝外膽管癌約占75％，肝內膽管癌占25％，肝內膽管癌的發病率僅次于原發性肝細胞癌，肝內膽管癌的組織學表現主要為膽管浸潤性和周圍浸潤性兩種類。在過去幾十年中膽管癌的發病率呈現上升趨勢，膽管癌的病因主要是膽汁淤積和慢性炎癥的微環境狀態引起。

目前，對于膽管癌的治療多以綜合治療為主，包括手術切除、全身化療、放療等。手術切除仍然是唯一一種可能根治是肝內膽管癌的治療方式，包括條件允許情況下的肝移植治療。如果錯過最佳手術機會，通常采取放療、化療或靶向治療等手段。目前，吉西他濱+順鉑的化療方案一直是晚期膽管癌的標準治療方案，不過效果仍有待提高，且容易發生耐藥。近幾年隨著高通量技術的發展，越來越多的膽管癌相關基因異常被發現。為靶向藥物的研發及靶向治療帶來了曙光。研究發現在超過70％的膽管癌中至少可以檢測到1個分子或遺傳突變，主要突變基因有KRAS、BRAF、FGFR1/2/3、IDH1/2等，其中FGFR1/2/3融合基因發生頻率較高。FGFR，即成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast Growth Factor Receptor)，FGFR家族主要包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4四種亞型，是負責細胞增殖和分化的酪氨酸激酶信號通路的一部分。現在已有多款針對該靶點的藥物正在積極的推進和發展并進入到臨床研究和審批階段，進展最快的FGFR抑制劑pemigatinib于2020年4月17日被美國食品藥品監督管理局(FDA)獲批上市。Pemigatinib是FGFR1、FGFR2和FGFR3選擇性競爭性抑制劑對攜帶FGFR2融合或重排的局部晚期或轉移性膽管癌患者的療效，治療反應率高達35.5％。因為，檢測膽管癌患者FGFR1/2/3融合基因，指導靶向治療可以進一步改善膽管癌患者的生存。

分析膽管癌的FGFR1/2/3基因的融合狀態可指導藥物治療，目前常用的檢測FGFR1/2/3基因融合的方法有多重熒光PCR方法和靶向捕獲高通量測序。多重熒光PCR法要實現涵蓋多種融合形式的檢測難度較大，往往需要分成多個反應管，增加成本。而靶向捕獲高通量測序根據技術路線可分為探針雜交捕獲和擴增子法。探針雜交捕獲雖然能檢測罕見的融合形式，但是建庫構成繁瑣，所需測序通量較大，分析難度也明顯增加。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供一種基于高通量測序檢測膽管癌FGFR1/2/3融合基因的文庫構建方法。該方法可用于定性檢測膽管癌患者石蠟組織切片樣本中FGFR1/2/3基因融合的狀態，共檢測33種融合形式。上述方法基于擴增子靶向捕獲高通量測序可以同時檢測多種常見的FGFR1/2/3融合基因，僅需要少量RNA逆轉錄成cDNA作為模板，在單管完成文庫的構建，操作簡單方便，僅需3.5個小時完成文庫構建，平均每個檢測成本大大縮減。

為達上述目的，本發明采用如下的技術方案：

一種基于高通量測序檢測膽管癌FGFR1/2/3融合基因的文庫構建方法，包括如下步驟：