[發(fā)明專利]一種基于高通量測序檢測膽管癌FGFR1/2/3融合基因的文庫構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011069119.6
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112144125B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳志宏;修陽斌;陳琰;康燦昆
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門飛朔生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06;C12Q1/6806;C12Q1/6858;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 李興林

本發(fā)明公開了一種基于高通量測序檢測膽管癌FGFR1/2/3融合基因的文庫構(gòu)建方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該文庫構(gòu)建方法包括如下步驟：(1)使用引物序列SEQ ID NO.1?67進行多重PCR擴增獲得文庫；(2)文庫的純化。該方法可用于定性檢測膽管癌患者包括手術(shù)切除的新鮮病理組織、甲醛固定石蠟包埋病例組織、石蠟切片等樣本中FGFR1/2/3基因融合的狀態(tài)，可檢測33種融合形式。該方法僅需要少量RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，在單管完成文庫的構(gòu)建，操作簡單方便，僅需3.5個小時完成文庫構(gòu)建，大大縮減了檢測成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于高通量測序檢測膽管癌FGFR1/2/3融合基因的文庫構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

膽管癌(cholangiocarcinoma)是起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤，其發(fā)生位置遍布于毛細膽管至膽總管。根據(jù)膽管癌的解剖學(xué)分類膽管癌分為肝內(nèi)膽管癌(iCCA)、肝門部膽管癌(pCCA)和遠端膽管癌(dCCA)；其中pCCA和dCCA也可統(tǒng)稱為“肝外CCA(eCCA)，其中肝外膽管癌約占75％，肝內(nèi)膽管癌占25％，肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病率僅次于原發(fā)性肝細胞癌，肝內(nèi)膽管癌的組織學(xué)表現(xiàn)主要為膽管浸潤性和周圍浸潤性兩種類。在過去幾十年中膽管癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，膽管癌的病因主要是膽汁淤積和慢性炎癥的微環(huán)境狀態(tài)引起。

目前，對于膽管癌的治療多以綜合治療為主，包括手術(shù)切除、全身化療、放療等。手術(shù)切除仍然是唯一一種可能根治是肝內(nèi)膽管癌的治療方式，包括條件允許情況下的肝移植治療。如果錯過最佳手術(shù)機會，通常采取放療、化療或靶向治療等手段。目前，吉西他濱+順鉑的化療方案一直是晚期膽管癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，不過效果仍有待提高，且容易發(fā)生耐藥。近幾年隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，越來越多的膽管癌相關(guān)基因異常被發(fā)現(xiàn)。為靶向藥物的研發(fā)及靶向治療帶來了曙光。研究發(fā)現(xiàn)在超過70％的膽管癌中至少可以檢測到1個分子或遺傳突變，主要突變基因有KRAS、BRAF、FGFR1/2/3、IDH1/2等，其中FGFR1/2/3融合基因發(fā)生頻率較高。FGFR，即成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast Growth Factor Receptor)，F(xiàn)GFR家族主要包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4四種亞型，是負責(zé)細胞增殖和分化的酪氨酸激酶信號通路的一部分。現(xiàn)在已有多款針對該靶點的藥物正在積極的推進和發(fā)展并進入到臨床研究和審批階段，進展最快的FGFR抑制劑pemigatinib于2020年4月17日被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)獲批上市。Pemigatinib是FGFR1、FGFR2和FGFR3選擇性競爭性抑制劑對攜帶FGFR2融合或重排的局部晚期或轉(zhuǎn)移性膽管癌患者的療效，治療反應(yīng)率高達35.5％。因為，檢測膽管癌患者FGFR1/2/3融合基因，指導(dǎo)靶向治療可以進一步改善膽管癌患者的生存。

分析膽管癌的FGFR1/2/3基因的融合狀態(tài)可指導(dǎo)藥物治療，目前常用的檢測FGFR1/2/3基因融合的方法有多重?zé)晒釶CR方法和靶向捕獲高通量測序。多重?zé)晒釶CR法要實現(xiàn)涵蓋多種融合形式的檢測難度較大，往往需要分成多個反應(yīng)管，增加成本。而靶向捕獲高通量測序根據(jù)技術(shù)路線可分為探針雜交捕獲和擴增子法。探針雜交捕獲雖然能檢測罕見的融合形式，但是建庫構(gòu)成繁瑣，所需測序通量較大，分析難度也明顯增加。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種基于高通量測序檢測膽管癌FGFR1/2/3融合基因的文庫構(gòu)建方法。該方法可用于定性檢測膽管癌患者石蠟組織切片樣本中FGFR1/2/3基因融合的狀態(tài)，共檢測33種融合形式。上述方法基于擴增子靶向捕獲高通量測序可以同時檢測多種常見的FGFR1/2/3融合基因，僅需要少量RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，在單管完成文庫的構(gòu)建，操作簡單方便，僅需3.5個小時完成文庫構(gòu)建，平均每個檢測成本大大縮減。

為達上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種基于高通量測序檢測膽管癌FGFR1/2/3融合基因的文庫構(gòu)建方法，包括如下步驟：