[發(fā)明專利]基于長DNA片段目標(biāo)捕獲及MinION長讀數(shù)對HLA探針文庫進(jìn)行測序的方法

有效

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• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112210597B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚斐
• 申請（專利權(quán)）人: 青島普澤麥迪生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6874
• 分類號: C12Q1/6874
• 代理公司: 青島清泰聯(lián)信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37256
• 代理人: 張潔

本發(fā)明提出一種基于長DNA片段目標(biāo)捕獲及MinION長讀數(shù)對HLA探針文庫進(jìn)行測序的方法，屬于生物技術(shù)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。該方法包括將提取的DNA片段化至10kb左右，通過連接擴(kuò)增接頭對其進(jìn)行擴(kuò)增，然后利用磁珠捕獲得到HLA目標(biāo)捕獲，再然后通過在捕獲的DNA上連接測序接頭，利用MinlON納米孔測序儀進(jìn)行DNA直接測序。本發(fā)明提供的測序方法可以根據(jù)需求對不同的HLA基因組合進(jìn)行測序，同時(shí)可以將不同的樣品進(jìn)行混合測序，最多可將24個(gè)樣品進(jìn)行混合測序，可大大節(jié)約測序成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于長DNA片段目標(biāo)捕獲及MinION長讀數(shù)對HLA探針文庫進(jìn)行測序的方法。

背景技術(shù)

人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因位于人體第6號染色體的短臂,受控于人類主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)的基因簇,其全長約3.6Mb,是目前所知人體最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)。

研究表明,HLA基因的變異與傳染病、藥物過敏反應(yīng)、自身免疫疾病、器官移植反應(yīng)以及惡性腫瘤等均有關(guān)聯(lián)。因此,準(zhǔn)確的HLA分型技術(shù)對于組織配型以及研究HLA與疾病相關(guān)性具有重要意義。但是由于MHC區(qū)域存在高度的多態(tài)性,因此研究人員對該區(qū)域所涉及到的分子機(jī)制的研究受到一定的限制。雖然第二代測序平臺NGS已經(jīng)取代了傳統(tǒng)基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及Sanger測序技術(shù)成為HLA分型的金標(biāo)準(zhǔn)(Lind C等，Next-generationsequencing:the solution for high-resolution,unambiguous human leukocyteantigen typing Hum Immunol,2010,71(10):1033-1042),但是NGS對單倍體型的判定的解析依然存在困難,而對單倍體分型能更好解讀基因與表型(包括疾病)之間的關(guān)系,尤其是對于HLA-DP等較大的HLA基因,NGS因其讀長短而很難準(zhǔn)確獲得單倍體型結(jié)果。

第三代測序儀能產(chǎn)生平均長度在10kb以上的數(shù)據(jù),這不但有利于基因精確分型,還能實(shí)現(xiàn)對基因組復(fù)雜區(qū)域的組裝以及對某個(gè)基因內(nèi)及等位基因間差異的細(xì)致解析。相比二代測序技術(shù)，三代測序技術(shù)在對同一樣品的HLA分型測定時(shí)具有不出現(xiàn)明顯“斷層”現(xiàn)象、可直接跨越整個(gè)擴(kuò)增子、不但能實(shí)現(xiàn)對MHC區(qū)域的更好組裝,還可對整個(gè)MHC共計(jì)3.6Mb區(qū)域進(jìn)行判定(陳佳等，三代測序與靶向捕獲技術(shù)聯(lián)用進(jìn)行高分辨HLA基因分型及MHC區(qū)域單倍體型精細(xì)鑒定，《遺傳》，2019,41(4):337-348，doi:10.16288/j.yczz.18-282)的技術(shù)優(yōu)勢。因此，如何利用長DNA片段目標(biāo)捕獲及MinION長讀數(shù)對HLA探針文庫進(jìn)行有效測序這對于本領(lǐng)域技術(shù)的發(fā)展而言具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出一種基于長DNA片段目標(biāo)捕獲及MinION長讀數(shù)對HLA探針文庫進(jìn)行測序的方法，該方法可以根據(jù)需求將不同的HLA目標(biāo)基因制作成探針文庫進(jìn)行測序，且最終的測序結(jié)果不受文庫大小的影響。此外，該方法可以將不同的樣品進(jìn)行混合測序，可大大節(jié)約測序成本。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種基于長DNA片段目標(biāo)捕獲及MinION長讀數(shù)對HLA探針文庫進(jìn)行測序的方法，包括以下步驟：

獲取樣本系的基因組DNA，對所得基因組DNA進(jìn)行片段化，并對所得片段化的DNA進(jìn)行末端修復(fù)；

將末端修復(fù)的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的擴(kuò)增的末端修復(fù)的片段化的DNA與HLA探針文庫進(jìn)行雜交，獲得雜交混合物；

利用磁珠捕獲所得雜交混合物中雜交的DNA片段，并洗滌去除未捕獲的DNA片段；

對磁珠捕獲的雜交的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到探針文庫的擴(kuò)增產(chǎn)物；

對所得到探針文庫的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)并連接條碼，得到條碼-末端修復(fù)的探針文庫；